Úvod
Soupravu na kvantitativní stanovení koncentrace kalcitoninu v séru a plazmě uvedla firma Roche na svých automatizovaných analyzátorech založených na technologii elektrochemiluminiscence na jaře minulého roku. Tento parametr nalézá své využití nejen při diagnostice a léčbě onemocnění štítné žlázy a příštítných tělísek, včetně karcinomu a hyperparatyreoidismu, ale také při diagnostice a léčbě hyperkalcemie a Pagetovy choroby.
Právě v rámci asi nejvyužívanější indikace - medulární karcinom štítné žlázy - se tento parametr rutinně využívá od poloviny roku 2013 v Centru pro tyreoidální onkologii a endokrinní orbitopatie při FN Motol na Klinice nukleární medicíny a endokrinologie. Vlastní stanovení se realizuje na tamním Ústavu lékařské chemie a klinické biochemie na analytickém systému cobas e 411. Před zavedením metody Elecsys se na tomto pracovišti používala pro tyto účely metoda IRMA Calcitonin od firmy IBL International. Nejen z důvodu odlišných deklarovaných citlivostí obou metod bylo nutné před zahájením rutinní aplikace stanovení Elecsys Calcitonin provést srovnání obou metod na sérii reálných pacientů v oblasti celé šíře měřícího rozsahu. Kromě toho byly prověřovány vlastnosti, jako je opakovatelnost či mezilehlá preciznost, a na základě více než půlročního měření byla rovněž zhodnocena reálná kalibrační stabilita metody.
Biochemické, fyziologické a klinické aspekty stanovení
Lidský kalcitonin (hCT) je proteohormonem složeným z 32 aminokyselin s molekulovou hmotností 3 418 Daltonů, který je vylučován primárně parafolikulárními C-buňkami štítné žlázy.1 Metabolizován je v játrech a ledvinách a regulován hladinami sérového vápníku. Fyziologicky ovlivňuje metabolismus vápníku a fosforu, působí antagonisticky k parathormonu (PTH). Kalcitonin také snižuje aktivitu osteoklastů, což napomáhá k následné inhibici resorpce kostí, ke které dochází nejen v postmenopauzálním období, ale i při tzv. kalciovém stresu (např. těhotenství, laktace a růst).2,3 Dosud byl CT izolován z více než 15 živočišných druhů. Léčebně se používá kalcitonin lidský, lososí a úhoří. Nejúčinnější je kalcitonin lososí.
Hladiny hCT v séru jsou relativně vysoké u kojenců a v průběhu dětství, v dospělosti prudce poklesnou a jsou pak relativně stabilní. Hladiny hCT v séru jsou obecně vyšší u mužů než u žen, přičemž kouření může vést k dalšímu nárůstu hladin v séru.4,5,6 Zvýšené hladiny hCT lze nalézt u různých patologických stavů, jako je např. medulární karcinom štítné žlázy. Zvýšený bývá hCT často rovněž při leukemických a myeloproliferativních poruchách7 nebo může být produkován ektopicky v nádorech, jako je např. karcinom plic (malobuněčný karcinom) nebo prsu.8,9,10 Zvýšené hladiny lze dále pozorovat ve spojení s hyperparatyreoidismem, hypergastrinemií, selháním ledvin a chronickým zánětlivým onemocněním.3,11 Hlavním klinickým syndromem spojeným s hypersekrecí hCT je medulární karcinom štítné žlázy (MTC), který tvoří 5 -10 procent všech karcinomů štítné žlázy a vyskytuje se v každém věku s maximem ve 4. - 6. decenniu života.16 Může se objevit sporadicky (70 - 75 procent případů) nebo ve familiární formě (25 - 30 procent případů), která se dědí jako autosomální dominantní znak, přičemž obě pohlaví jsou postižena stejně. Klinicky se tato forma vyskytuje nejčastěji ve 2. a 3. decenniu života. Klinicky se MTC obvykle projeví strumou, popř. uzlem s typickou lokalizací ve středních partiích a při horních pólech štítné žlázy, kde je fyziologicky nejvyšší koncentrace C-buněk.
U nemocných s již hmatným nádorem je časté i metastatické postižení regionálních lymfatických uzlin, u sporadických forem až v 65 - 70 procentech případů. Funkce štítné žlázy bývá obvykle normální, struma ani uzliny nebývají palpačně citlivé a přes vysoké hladiny kalcitoninu nebývá zaznamenán pokles hladiny vápníku v krevním séru. U malého, ale narůstajícího procenta pacientů jsou však bazální hladiny hormonu nerozlišitelné od normálních. Někteří z těchto subjektů představují raná stadia neoplázie C-buněk nebo hyperplázii, které se nejčastěji řeší chirurgickým zásahem. K identifikaci těchto pacientů v raném stadiu nemoci je nezbytné použít stimulační test pro sekreci hCT, aby došlo k vyloučení falešně negativních výsledků. Většina nádorů reaguje nárůstem hladin hCT po podání vápníku nebo pentagastrinu nebo použitím obou způsobů stimulace.14,15
Totální tyreoidektomie a odstranění veškeré přítomné nádorové tkáně je základem léčby jak u familiární, tak i sporadické formy MTC. Po chirurgickém výkonu je v odstupu tří měsíců ve FN Motol v následném sledování pacientů s MTC provedeno měření kalcitoninu vždy zároveň se stimulačním testem (glukonát vápenatý v dávce 2,5 - 3 mg elementárního kalcia/kg tělesné hmotnosti) měření kalcitoninu, kde zvýšené hodnoty ukazují na nedostatečnou radikalitu chirurgické léčby či výskyt metastatických ložisek, které je nutno potvrdit zobrazovacími metodami (ultrazvuk krku, CT, scintigrafie, PET/CT). Kompletní remise je potvrzena neměřitelnou hladinou kalcitoninu. U pacientů s prostou a polynodózní strumou se zvýšeným bazálním hCT nad 100 ng/L či stimulovaným kalcitoninem (3 - 5x vyšší hodnota po stimulaci) je diagnóza MTC jistá. Naopak normální hladina kalcitoninu medulární karcinom prakticky vylučuje. Stanovení hladiny kalcitoninu je proto nezbytné u pacientů při klinickém podezření na malignitu či při nejasném cytologickém nálezu.23
Design a analytické vlastnosti metody Elecsys Calcitonin
Stanovení Elecsys Calcitonin využívá monoklonální protilátky specificky směřované proti hCT. Protilátky značené rutheniovým komplexem se skládají z myších specifických komponent. Na obrázku č. 1 je znázorněn design celého stanovení.
Princip zkoušky: jednokroková sendvičová analýza
1. inkubace (9 minut)
Inkubuje se 50 μL vzorku, biotinylovaná specifická monoklonální protilátka proti hCT a specifická monoklonální protilátka proti hCT značená rutheniovým komplexem. Vznikne sendvičový komplex s hCT a oběma protilátkami.
2. inkubace (9 minut)
Po přidání mikročástic pokrytých streptavidinem se komplex díky interakci biotinu a streptavidinu naváže na pevnou fázi.
Měření
Reakční směs je nasáta do měřicí cely, kde se mikročástice magneticky zachytí na povrchu elektrody. Poté se odstraní nenavázané látky. Napětí přivedené na elektrodu pak indukuje chemiluminiscenční emisi, která se měří fotonásobičem.
Uvedená tabulka č. 1 sumarizuje nejdůležitější analytické charakteristiky obou používaných metod. V případě IRMA metody se pracuje v sériích, kdy vlastnímu stanovení koncentrace v pacientském vzorku předchází šestibodová kalibrace v duplexu a následná kontrola kvality na dvou hladinách rovněž v duplikátu. Příbalový leták metody IRMA navíc hovoří o nutnosti stanovení koncentrace prokalcitoninu u pozitivních vzorků z důvodu odhalení falešné pozitivity.
„Random access“ stanovení Elecsys se pyšní vysokou mírou kalibrační stability. V motolské laboratoři nebylo nutno po celou dobu měření metodu rekalibrovat při trvalém pobytu soupravy na palubě analyzátoru. Zkušenosti z jiných pracovišť, kde se provádí stanovení kalcitoninu s nižší četností, potvrzují rovněž tato zjištění s tím, že se prakticky kalibruje pouze s novou šarží reagencie.
Parametry opakovatelnosti - viz tabulka č. 3 a mezilehlé preciznosti - viz tabulka č. 2 metody Elecsys byly ověřovány pracovníky ÚLCH a KB FN Motol a výsledky uvedené v přiložených tabulkách demonstrují vysokou míru shody s daty deklarovanými příbalovým letákem.
Porovnání metod
Zkraje této části bychom rádi poděkovali RNDr. Zdenku Kubíčkovi za vlastní provedení statistického porovnání obou metod pomocí programu MedCalc. Pro tyto účely byly zvoleny Passing-Bablokova regrese - viz tabulky č. 5, 6, 7 a graf č. 1 a Bland-Altmannův rozdílový graf - viz graf č. 2. Níže uvedená tabulka č. 4 demonstruje surové výsledky dosažené oběma metodami u 43 pacientů. Jak již bylo řečeno, u pacientů s hodnotami 0,50 ng/L došlo k úplné tyreoidektomii. Hodnota 0,5 ng/L tak představuje spodní limit měřícího rozsahu a koncentrace kalcitoninu jsou v těchto případech neměřitelné.
Jsme si vědomi toho, že statistická vypovídací hodnota tohoto porovnání je značně snížena nedostatečným množstvím použitých probandů. Navíc plných 18 výsledků z celkových 43 u metody Elecsys Calcitonin představuje neměřitelnou hodnotu po totální tyreoidektomii, zaznamenanou v SW analyzátoru jako 0,5 ng/L. Nicméně i přesto je možné konstatovat, že přes velké rozdíly v povaze, citlivosti a přesnosti obou metod bylo dosaženo uspokojivé korelace. Odchylky jsou v rámci klinického hodnocení nevýznamné. Vyšší průměrná diference v Bland-Altmannově rozdílovém grafu je ovlivněna právě vysokým počtem neměřitelných hodnot kalcitoninu metodou Elecsys, což je přičítáno lepší analytické sensitivitě a specifičnosti této metody.
Závěr
Diagnostický marker kalcitonin je citlivý a specifický nádorový marker pro diagnostiku i celoživotní sledování pacientů s MTC po operaci štítné žlázy.17,18,19,20,21,22 Parametr vykazuje vysokou míru korelace s nádorovou zátěží a napomáhá včasné detekci nových zbytkových onemocnění.18 Některá guidelines dokonce doporučují screening kalcitoninu u všech pacientů s tyreoidálními uzly.17,20 Zavedení metody Elecsys s vylepšenou citlivostí a specifičností tvrzení těchto guidelines ještě více podporuje. Test Elecsys Calcitonin disponuje nadstandardními analytickými vlastnostmi a splňuje tak veškeré požadavky, které jsou na dnešní moderní metody kladeny. Uvedením tohoto stanovení Roche doplňuje své špičkové portfolio automatizovaných vyšetření tyreoidálních markerů, které tak zahrnuje nejen úplnou nabídku protilátek, nýbrž také parametry pro management onkologických onemocnění štítné žlázy (Calcitonin, Elecsys Tg hs).