article main title
Srovnání naměřených výsledků D-dimerů POCT přístrojem cobas h 232 s výsledky získanými z laboratorních analyzátorů
doc. MUDr. Tomáš Kvasnička, CSc. 1 , Mgr. Ivana Malíková 2 , Bc. Petra Linhartová 3
1) Trombotické centrum, VFN, 1. LF UK, Karlovo nám. 32, Praha 2, www.vfn.cz
2) ÚLBLD Centrální hematologické laboratoře a Trombotické centrum VFN, U Nemocnice 499/2, 128 08 Praha 2
3) Trombotické centrum, ÚLBLD, VFN a 1. LF UK, Praha

V rutinní laboratorní praxi jsou pro detekci D-dimerů dostupné testy zahrnující latexovou aglutinaci, imunoturbidimetrii a enzymatický imunosorbentní test (ELISA). Negativní výsledek vyšetření D-dimerů (koncentrace nižší nebo rovna hraniční hodnotě) prakticky vylučuje hlubokou žilní trombózu a plicní embolii. Naopak pozitivní výsledek už není pro trombózu tak specifický. Nový typ POCT analyzátoru cobas h 232 je přístroj pro kvantitativní vyhodnocení imunotestů pro kardiovaskulární (troponin T, CK-MB, myoglobin, NT-proBNP) nebo tromboembolické markery (D-dimer) s použitím techniky značení zlatem. Přístroj představuje nový způsob používání a byl vyzkoušen v ambulancích Trombotického centra ÚLBLD VFN a 1. LF UK v Praze pro detekci hladin D-dimerů. V porovnání s daty získanými na několika dalších analyzátorech využívaných v rutinní klinické praxi byly zjištěny vysoké hodnoty koeficientů R2 regresní analýzy (0,851–0,989), což ukazuje na velmi dobrou porovnatelnost s referenčním analyzátorem a je důležitým kritériem pro zařazení nového analyzátoru do laboratorní praxe.

Úvod

Obr. 1: Přístroj cobas h 232 umístěný v Trombotickém centru VFN Praha

D-dimer je fragment proteinu, který vzniká, když enzym plazmin odbourává fibrinovou sraženinu stabilizovanou příčnými vazbami (vytvořenými působením faktoru XIII). Tento proces se nazývá fibrinolýza a opakovaným působením plazminu se vysokomolekulární polymery fibrinu štěpí na fibrinové fragmenty různé velikosti (fibrin degradační produkty). Konečný produkt odbourávání D-dimer je složen z jedné proteinové podjednotky E a ze dvou D podjednotek spojených příčnou vazbou (plazmin neštěpí tyto příčné vazby). Právě kvůli obsahu dvou D podjednotek se označuje produkt jako D-dimer. D-dimery jsou detekovány imunotesty pomocí monoklonálních protilátek specifických pro zesíťovanou doménu D-dimeru ve fibrinogenu. Komerčně dostupné testy zahrnují latexovou aglutinaci, imunoturbidimetrii a enzymatický imunosorbentní test (ELISA), avšak jednotlivé testy nejsou navzájem komparabilní a snahy o standardizaci výsledků nebyly dosud úspěšné. V praxi nejčastěji používanými metodami jsou latexová imunoturbidimetrie nebo enzyme-linked immunofluorescence assay (ELFA), vhodné i v případě akutních stavů. Všechny používané techniky (ELISA, ELFA i latexová imunoturbidimetrie) vykazují vysokou senzitivitu, avšak na úkor nízké specificity. Tato skutečnost vede k velkému množství „nadbytečných“ ultrazvukových vyšetření (US) či CT angiografií (CTA). Negativní prediktivní hodnota testů – vyloučení přítomnosti hluboké žilní trombózy (DVT)/plicní embolie (PE) – je vysoká, avšak pozitivní prediktivní hodnota je naopak nízká. Hladinu D-dimeru zvyšuje nejen přítomnost PE či DVT, ale i zvýšení jeho prekurzoru – fibrinogenu, který plní v organismu mnoho zásadních funkcí. Nejznámější je jeho role v hemokoagulaci a fibrinolýze. Zároveň tato molekula slouží při vzájemné interakci buněk a pojivové tkáně v průběhu hojení ran a procesu neoplazie. Fibrinogen reaguje s fibronektinem, heparinem nebo s endoteliálními kadheriny, čímž podporuje tvorbu kapilár a angiogenezi. Stejně tak interaguje s imunitními buňkami, které stimuluje v průběhu zánětlivé reakce.

Tab. 1: Základní charakteristiky přístrojů

Z toho vyplývá, že existují stavy vedoucí k trvalému zvýšení hladiny D-dimeru. Jedná se například o věk vyšší než 70 let, cévní aneuryzmata, maligní nádory, vrozené cévní malformace, systémová onemocnění pojiva, jaterní cirhózu či nefrotický syndrom a chronické renální selhání. Ke stavům spojeným s přechodným zvýšením hladin D-dimerů patří DVT, PE a tromboflebitida, ale také diseminovaná intravaskulární koagulopatie (DIC), operace provedená v posledních 4 týdnech, traumata i větší hematomy, aortální disekce, přítomnost infekce či nádorového onemocnění v organismu, akutní stavy, jako je infarkt myokardu, cévní mozková příhoda nebo končetinová ischemie a další. Koncentrace D-dimerů se udává v DDU jednotkách (z anglického D-dimer units, D-dimer jednotky) ng/ml DDU nebo mg/l DDU, označení DDU se obvykle vynechává). Nebo se používají FEU jednotky (fibrinogen ekvivalentní jednotky, ng/ml FEU nebo mg/l FEU, označení FEU se musí uvádět). Použití jednotek závisí na druhu diagnostické soupravy.

Význam monitoringu D-dimerů v klinické praxi

Výsledek testu se považuje za negativní, pokud je koncentrace D-dimerů nižší než 0,25 mg/l nebo 0,5 mg/l FEU. Tyto hraniční hodnoty může doporučit výrobce testu nebo si je mírně upraví sama laboratoř podle místních podmínek. Negativní výsledek vyšetření D-dimerů (koncentrace nižší nebo rovna hraniční hodnotě) prakticky vylučuje hlubokou žilní trombózu a plicní embolii. Negativní výsledek znamená, že v těle se ve zvýšené míře nevytváří a neodbourávají krevní sraženiny. Naopak pozitivní výsledek už není pro trombózu tak specifický. Stavy spojené s trvalým nebo přechodným zvýšením byly uvedeny výše. Vyšetření D-dimerů pak jen přispívá k potvrzení diagnózy těchto onemocnění. Pozitivní výsledek znamená, že se vytvořily významné fibrinové sraženiny a ty se nyní odbourávají. Už ale není jasné, kde se vytvořily a co bylo příčinou. Pro klinické použití hladin D-dimeru je nutno znát přesnou anamnézu pacienta. K tomuto slouží Pre-Wellsovo skórování amnestických údajů popisující nebezpečí DVT.

Zahrnuje stavy zvyšující riziko (například aktivní nádorové či infekční onemocnění, imobilizace, operace, edémy na končetinách) a klasifikuje pravděpodobnost postižení pacienta trombózou. V případě plicní embolie je možnost využít Ženevské skóre nebo Wellsova kritéria. Všechny tyto skórovací systémy rozdělují pacienty do tří skupin podle pravděpodobnosti DVT/PE – nepravděpodobná (LCP), pravděpodobná (ICP) a vysoce pravděpodobná (HCP). Nový typ POCT analyzátoru cobas h 232 je přístroj pro kvantitativní vyhodnocení imunotestů pro kardiovaskulární (troponin T, CK-MB, myoglobin, NT-proBNP) nebo tromboembolické markery (D-dimer) s použitím techniky značení zlatem. Přístroj představuje nový způsob používání a byl vyzkoušen v ambulancích Trombotického centra ÚLBLD VFN a 1. LF UK v Praze pro detekci hladin D-dimerů v průběhu roku 2019. Cílem sledování bylo získat výsledky od pacientů z analyzátoru cobas h 232 a porovnat je s daty získanými na několika dalších analyzátorech využívaných v rutinní klinické praxi.

Metody

Standardizace je u stanovení D-dimerů velmi obtížná, proto jsme museli mezipřístrojově porovnávat nejen prosté hodnoty, ale i principy stanovení, jednotky a také cutt-off hodnoty.

cobas h 232

Přístroj pro kvantitativní vyhodnocení D-dimeru pomocí imunotestu s použitím techniky značení zlatem. Hodnocení lze provést přímo na místě odběru vzorků krve. Přístroj cobas h 232 má snadné a rychlé ovládání, vkládá se do něj diagnostický proužek a nanáší vzorek plné krve odebrané do zkumavky s antikoagulačním přípravkem – natrium nebo lithium heparin.

cobas t 511

Automatický koagulometr, který používá kazetový systém reagencií, přičemž jsou reagencie rekonstituovány přímo v analyzátoru. D-dimery se stanovují pomocí latexových částic, které jsou potažené monoklonální protilátkou proti epitopu D-dimeru. Po přidání vzorku obsahujícího D-dimery se vytváří komplexy antigen–protilátka, což vede k nárůstu zákalu reaktantů. Změna absorbance v čase je závislá na koncentraci epitopů D-dimeru ve vzorku.

Obr. 2 (vlevo): Koagulometr cobas t 511 umístěný v Centrální hematologické laboratoři (CHL) VFN
Obr. 3 (vpravo): Analyzátor miniVidas 

miniVidas

Analyzátor s fluorescenční detekcí, kde stanovení D-dimerů spočívá v kombinaci dvoukrokové sendvičové enzymatické imunoanalýzy se závěrečnou detekcí pomocí fluorescence (ELFA). Základem testu je pevná fáze, tj. špička s navázanými protilátkami proti epitopu D-dimeru. Ve špičce je vzorek inkubován a pomocí ní pipetován mezi jednotlivými sekcemi stripu. V poslední jamce je na konci testu změřen fluorescenční signál a ten je následně přepočítán na koncentraci.

Sysmex CS 5100

Automatický koagulometr, který používá pro měření jednotlivé reakční kyvety. D-dimery se stanovují pomocí mikrolatexových částic, které jsou potažené monoklonální protilátkou proti epitopu D-dimeru. Imunologická reakce se projeví změnou propustnosti světla.

BCS XP

Automatický koagulometr, který používá pro měření reakční rotory. D-dimery se stanovují stejně jako u předchozího analyzátoru pomocí mikrolatexových částic. V měřicí kyvetce rotoru vznikne při imunologické reakci zákal, jehož intenzita se proměřuje turbidimetricky.

Obr. 4 (vlevo): Koagulometr Sysmex CS 5100 
Obr. 5 (vpravo): Koagulometr BCS XP

Charakteristika souboru

Pro měření byly použity vzorky heparinové krve u přístroje cobas h 232 a citrátové plazmy u ostatních přístrojů (cobas t 511, miniVidas, Sysmex CS 5100 a BCS XP).

Tab. 2: Charakteristika sledovaného souboru

Výsledky

  • Mezipřístrojové porovnání I

V Trombotickém centru jsou umístěny dva stejné přístroje cobas h 232, proto jsme se v první fázi zaměřili na mezipřístrojové porovnání u 33 vzorků přímo v ambulanci. Výsledky jsme vyhodnotili pomocí vícenásobné regresní analýzy v programu Statistica 12. Výsledný R2 koeficient 0,992 svědčí pro velmi dobrou porovnatelnost.

  • Mezipřístrojové porovnání II

Všechny vzorky ze sledovaného souboru byly změřeny na přístroji cobas h 232 a zároveň na dalších čtyřech výše uvedených analyzátorech. Pro grafické znázornění a větší přehlednost byly hodnoty z analyzátorů BCS XP a Sysmex CS 5100 upraveny pomocí koeficientu vztaženého ke cut-off.

Graf 1 (vlevo): Lineární regrese stanovení D-dimerů na cobas h 232 (1 a 2)
Graf 2 (vpravo): Krabicové grafy stanovení D-dimerů na všech analyzátorech

Závěr

Zjištěné vysoké hodnoty koeficientů R2 regresní analýzy (0,851–0,989) ukazují na velmi dobrou porovnatelnost s referenčním analyzátorem i jednotlivých analyzátorů mezi sebou. Porovnání s referenčním analyzátorem je důležitým kritériem pro zařazení nového analyzátoru do laboratorní praxe. Při porovnání vzorků pacientů s negativními hodnotami nebyly nalezeny významné rozdíly hodnot získaných z jednotlivých analyzátorů. Rovněž u pacientů s prokázanou trombózou byly naměřeny vysoké hodnoty na všech přístrojích. Stanovení D-dimerů patří obecně k nejvíce problematickým stanovením v hemostáze a jen velmi těžko se jednotlivá měření porovnávají. Rozdíly ve stanovení mohou být způsobeny složením kitu, typem monoklonální protilátky navázané na latexových částicích, vlnovou délkou měření a typem analyzátoru. Je potřeba brát také v úvahu uváděné jednotky výsledku a normální rozmezí. Při výběru diagnostického testu je rovněž vhodné uvážit rychlost a podmínky stanovení a diagnostický přínos. Přístroj cobas h 232 je ideální pro použití na urgentních příjmech, jednotkách intenzivní péče, v odborných ambulancích (kardiologie, angiologie, interna) nebo u praktických lékařů.

Práce byla podpořena projektem RVO-VFN64165. Použitá literatura k dispozici u autora textu.

doc. MUDr. Tomáš Kvasnička, CSc.

doc. MUDr. Tomáš Kvasnička, CSc.


Je vedoucím pracoviště Trombotického centra Všeobecné fakultní nemocnice, 1. lékařské fakulty, Univerzity Karlovy.

Mgr. Ivana Malíková

Mgr. Ivana Malíková


Pracuje v hematologické laboratoři již od roku 1994. Hlavní odborná orientace zahrnuje problematiku poruch hemostázy a automatizaci v laboratoři. V současné době pracuje jako vedoucí hematologické laboratoře v areálu fakultní nemocnice a jako vedoucí úseku koagulací v laboratoři na fakultní poliklinice. Problematice automatických analyzátorů se věnuje více než patnáct let. I když své práci věnuje hodně času, ráda si najde chvilky na cestování, kdy s nadšením poznává nová místa, jinou kuchyni, kulturní zvyky. S tím tak trochu souvisí i další záliby, jako jsou koncerty, divadlo, četba. Rekreačně sportuje, ve velké oblibě má tanec a hodně času, hlavně o víkendech, věnuje chalupaření.

Bc. Petra Linhartová

Bc. Petra Linhartová


Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.