Glykovaný hemoglobin (HbA_1c) je rutinně využívaný parametr pro sledování kompenzace glykemie u pacientů s diagnózou diabetes mellitus.¹ V řadě zemí je také využíván jako diagnostický marker pro toto onemocnění.² Efektivní využití HbA_1c je ovšem limitováno jeho analytickou nejistotou³ a omezeními vyplývajícími z přítomnosti abnormální formy hemoglobinu, intravaskulární hemolýzy, ztráty krve a dalších stavů. Na přesnost vyšetření HbA_1c jsou tudíž kladeny poměrně vysoké nároky.⁴ Proto je velmi žádoucí vývoj metodiky stanovení a snižování analytické nejistoty tohoto markeru.

HbA_1c je měřen celou škálou analytických principů. V ČR je dominantní především iontoměničová HPLC, ale objevují se i afinitní chromatografie, imunoanalytické metody, enzymatické metody, kapilární elektroforéza a suchá chemie.⁵ V  této studii jsme se zabývali porovnáním rutinní iontoměničové HPLC metody na analyzátoru D-10 (Bio-Rad) s inhibiční imunoanalytickou metodou na analyzátoru cobas^® 8000 modulu c 502 (Roche).

Materiály a metody

Sběr vzorků pacientů pro studii probíhal na pracovišti Fakultní nemocnice Brno od 14. 5. 2020 do 5. 6. 2020. Do porovnání bylo zahrnuto 112 vzorků pacientů, které byly v uvedeném období rutinním způsobem vyšetřeny pro hodnotu HbA_1c na analyzátoru D-10 (Bio-Rad) pomocí reagenčního setu D-10 Dual Program Reorder Pack. Další faktory jako věk, diagnóza, pohlaví a podobně nebyly zohledněny. Materiály byly po rutinním vyšetření uloženy v lednici při 4–8 °C (stabilita parametru HbA_1c je alespoň 7 dní při této teplotě).⁶ Po ukončení rutinního provozu byly vzorky v  odpoledních hodinách roztřepáním homogenizovány a analyzovány na cobas^® 8000 c 502 metodou HbA1c TQ Gen. 3 (Roche).

S každou sérií vzorků proběhlo měření dedikované kontroly kvality na  každém z analyzátorů (viz tabulka 1). Ke spolehlivému určení hodnoty bias a posouzení stability reagencií metody HbA_1c TQ Gen. 3 na palubě přístroje byly použity referenční lyofilizované materiály vzorků A i B cyklu KD2/20 fy SEKK. Cílové hodnoty a  jejich rozšířené nejistoty byly 38,2 (UAV = 0,6) a 70,1 (UAV = 1,1) mmol/mol. Každý z  materiálů byl měřen v pěti opakováních na  analyzátoru cobas^® 8000 modulu c 502 v den 1 a poté ve čtyřech opakováních v den 11 (viz tabulka 2). Stabilita resuspendovaných materiálů byla zajištěna jejich zamrazením v den 1 na -20 °C.

Ke statistickému vyhodnocení byl využit program MedCalc verze 9.3.2.0. Korelace byla vyhodnocena dle Passinga a Babloka (1983)⁷ a korelační koeficient vypočten dle Pearsona. K hodnocení byly vždy použity hodnoty HbA_1c definované dle IFCC [mmol/mol]. Přepočet jednotek IFCC a DCCT (NGSP) je možné provést dle následující rovnice: DCCT(%) = 0,0915 * IFCC(mmol/mol) + 2,15

Výsledky

Porovnání vzorků pacientů proběhlo celkem v 7 sériích po dobu 19 dní a zahrnuje 112 měření na  každém z  přístrojů, viz obrázek 1. Rovnice lineární regrese včetně 95% intervalů spolehlivosti jsou zaznačeny v tabulce 1.

Hodnoty HbA_1c vzorků pacientů se pohybují v rozmezí 33–108 mmol/mol pomocí iontoměničové HPLC metody na analyzátoru D-10 (Bio-Rad) a v rozmezí 29,5–104 mmol/mol pomocí metody HbA_1c TQ Gen. 3 (Roche). Výsledky, které analyzátor poskytoval po dobu studie, byly vždy v povoleném rozmezí definovaném každým z výrobců kontrolních materiálů, viz tabulka 2.

Cílové hodnoty referenčního materiálu, jednotlivé naměřené hodnoty i statistické vyhodnocení druhé části studie, shrnující bias a stabilitu reagenčního setu HbA_1c TQ Gen. 3, jsou uvedeny v tabulce 3. Materiály KD2/20 (SEKK) byly rozpuštěny dle instrukcí pro uživatele Roche, tedy v 0,25 ml deionizované vody. Cílové hodnoty obou materiálů byly získány referenční laboratoří (European Reference Laboratory for Glycohemoglobin), s metrologickou návazností na referenční metodu IFCC (Winterswijk, Nizozemsko).⁸ Párový t-test ukázal shodu dat pro dny 1 a 11 u vzorků A i B.

Diskuse

Porovnání výsledků HbA_1c u  pacientských vzorků ukazuje velmi dobrou shodu obou metod – statisticky nevýznamný rozdíl směrnice a mírný negativní bias reagenční soupravy Roche v  průměru o 2,1 mmol/mol HbA_1c. Pokud přihlédneme k  průběžně měřeným interním kontrolám kvality, kdy analyzátor D-10 vykazuje mírný pozitivní bias oproti referenční hodnotě a analyzátor c 501 negativní, můžeme usoudit, že je tento bias tvořen parciálně oběma metodami.

Analýza referenčních materiálů naopak ukazuje mírný pozitivní bias reagenční soupravy Roche v den instalace setu do přístroje a  jeho kalibrace i po desíti dnech. Tato nekonzistence s  předchozí částí studie může být vysvětlena jinou povahou matrice obou materiálů. Zatímco soubor pacientských vzorků tvoří nativní krev, referenční materiály dodávané firmou SEKK jsou lyofilizáty. Problematika efektu matrice je v případě glykovaného hemoglobinu dosud hojně diskutovaná. V ČR se tento problém projevoval především u některých POCT analyzátorů HbA_1c, což bylo od roku 2017 kompenzováno použitím materiálů nativní krve. Přesto, mírné odchylky u  laboratorních přístrojů se u nás dosud neprojevily nejspíše i díky dostatečně široké maximální povolené odchylce při hodnocení EHK fy SEKK. Během několika posledních let ovšem došlo k  zúžení tohoto intervalu z ±20 % na současných ±12 %. Další zužování povoleného intervalu naráží na současné technické možnosti analýzy. Evropská srovnávací studie EURAAA1c, jíž se zúčastnila právě i  ČR v roce 2019, ukazuje vyšší průměrný bias i CV% u lyofilizátů (bias = +1,1 mmol/mol HbA1c, CV = 6,2 % oproti analýze plné krve %) (bias = +0,4 mmol/mol HbA_1c, CV = 4,6 %).⁹

Pro laboratoře s  menším objemem vzorků k vyšetření HbA_1c může být důležitá stabilita reagencií na  palubě. Tabulka 3 ukazuje shodné výsledky měřené v den vložení reagencie do  přístroje a  poté po 10 dnech. Výsledky ukazují statisticky nevýznamný rozdíl cílových hodnot (párový t-test) i variačních koeficientů (párový F-test). Kvůli malému množství referenčního materiálu nebylo možné provést větší počet opakování, aniž bychom se vyhnuli míchání jednotlivých lahviček, ovšem sloučením obou skupin bychom získali bias +2,0  mmol/mol a CV 2,3  % pro vzorek A a bias +2,7 mmol/mol a CV 1,0 % pro vzorek B.

K nesporným výhodám řešení fy Roche patří využití stávajícího automatického fotometrického analyzátoru, takže není třeba zakupovat/pronajímat další přístroj a  řešit související agendu – prostorové nároky, údržbu, zaškolení personálu, dokumentaci. Současná třetí generace reagenčních setů je dostupná pro přístroje cobas b 101, c 501/502, c 513, c 311/111, Integra, c 503. 

Závěr

V této práci jsme demonstrovali, že i tak rozdílné metody pro stanovení HbA_1c, jakými jsou iontoměničová HPLC a inhibiční imunoanalýza, mohou poskytovat dobrou korelaci. Požadavky na  analytickou kvalitu metody HbA_1c TQ Gen. 3 (Roche) vyhovují současným českým i mezinárodním požadavkům.