article main title
Interference heterofilních protilátek a HAAA/HAMA při stanovení srdečních troponinů existuje, ale je vzácná
Prof. MUDr. Antonín Jabor, CSc. 1 , MUDr. Janka Franeková, Ph.D. 1
1) Pracoviště laboratorních metod IKEM Praha a 3. lékařská fakulta UK Praha

Úvod

Interference při imunochemických analýzách představuje problém, který lze pouze minimalizovat. Komplexní prostředí reakce mezi antigenem a protilátkou je z hlediska možných interferencí choulostivé tím, že různé analyty mohou být různě ovlivněny interferenty nejen při stanovení pomocí rozdílných diagnostických souprav, ale i při obdobném principu stanovení na jednom analytickém systému. Zvláštní problematiku tvoří interference způsobené vysoce specifickými lidskými protilátkami proti zvířecím antigenům (Human-Anti-Animal-Antibodies, HAAA), jejichž podskupinu tvoří HAMA (Human-Anti-Mouse-Antibodies), tj. specifické protilátky s vysokou afinitou. 

Interferenci mohou způsobit také heterofilní protilátky polyspecifické, s nízkou nebo střední afinitou k antigenům nebo autoantigenům. Popisujeme příklad spolupráce mezi laboratoří a výrobcem diagnostické soupravy při identifikaci příčiny možné interference stanovení srdečního troponinu. Výchozí klinickou situací byl diskrepantní nález výsledků srdečních troponinů stanovených různými metodami u pacientky bez jednoznačného postižení myokardu. Uvádíme také analýzu literárních údajů o podobných interferencích. Cílem je ukázat na potřebu spolupráce mezi klinickou laboratoří, ošetřujícími lékaři, pacientem a v neposlední řadě i výrobcem diagnostické soupravy.

Kazuistika

Polymorbidní pacientka (diabetes mellitus 2. typu, léčená hypertenze, dyslipidemie, vertebrogenní algický syndrom, st.p. excizi fibroadenomu prsu, chronický blok levého Tawarova raménka, osteoporóza, gastroezofageální reflux, malá hiátová hernie, st.p. excizi kožního melanomu bez známek diseminace při sledování) byla opakovaně přijata k vyšetření s bolestí na hrudi bez jasné evidence infarktu myokardu. Opakovaně byly zjištěny zvýšené kon-centrace hs-cTnT bez klinického korelátu. Koncentrace hs-cTnT (99. percentil „zdravé“ populace 14 ng/l) se zvýšily v průběhu sledování ze 120,1 ng/l na 280,4 ng/l během osmiměsíční periody, s poklesem na 216,3 ng/l během následujícího měsíce, s opakovaně negativním troponinem I (TnI), vysoce senzitivním troponinem I (hs-cTnI), myoglobinem a CK-MB mass. Vzhledem k nesouladu klinického stavu a rozdílným laboratorním nálezům byl použit algoritmus podle Vafaie1 a Bluma2 k vyloučení nebo potvrzení interference. Koncentrace ostatních potencionálně ovlivněných analytů stanovených na stejném systému (cobas® 6000) nebyly nijak ovlivněny a byly pod referenční mezí (PSA, CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA 125). Autoprotilátky (ANCA, anti-myokard) byly negativní, stejně jako revmatoidní faktor, cirkulující imunokomplexy a C1q složka komplementu. Sérum pacientky nebylo hemolytické, ikterické ani lipemické, diskrepantní výsledky byly pozorovány opakovaně v séru a plazmě i po pečlivé separaci elementů centrifugací. Myoglobin byl 31 µg/l, CK-MB mass 1,92 µg/l, cTnI stanovený na systému Mitsubishi Pathfast byl 2 ng/l, „konvenční“ cTnI Abbott Architect byl trvale pod 0,03 µg/l, hs-cTnI Abbott Architect byl opakovaně mezi 2,6–14 ng/l (99. percentil 24 ng/l). Pacientka neměla chronické onemocnění ledvin (kreatinin 79,2–92,4 µmol/l, enzymové stanovení s referenčním rozmezím pro ženy 49–90 µmol/l). Nebylo prokázáno strukturální onemocnění myokardu na MRI, s výjimkou drobné fibrózy septa, echokardiografie a EKG byly bez závažné patologie, svalové onemocnění nebylo pravděpodobné při celkové aktivitě CK 0,89 µkat/l. Na konci sledování byla u pacientky prokázána plicní embolizace, která se paradoxně neprojevila v žádném z vyšetřených kardiomarkerů.

Laboratorní analýzy k prokázání/vyloučení interference

Vzhledem k trvalému podezření na interferenci (buď negativní interference u stanovení cTnI, nebo pozitivní interference stanovení cTnT) byl postupně proveden diluční test pro vyloučení pozitivní interference (bez jednoznačného výsledku), test s přídavkem vysoké koncentrace cTnI pro vyloučení negativní interference cTnI (bez jednoznačného výsledku) a ošetření séra pacientky činidlem blokujícím heterofilní protilátky (Skybio blocking tubes). Pouze tento test vedl jednoznačně k eliminaci interference: sérum pacientky s koncentrací hs-cTnT 280,4 ng/l mělo po použití blokující substance koncentraci 16,5 ng/l (tj. 5,8 % původní koncentrace). Další experimenty proběhly v laboratořích výrobce (R&D Roche), kde byla prokázána vzácná interference stanovení hs-cTnT způsobená proteinem o vysoké molekulové hmotnosti, odpovídající molekulové hmotnosti IgM. Šlo o celosvětově druhou interferenci stanovení hs-cTnT s heterofilními nebo HAMA protilátkami od vstupu této diagnostické soupravy na trh v roce 2009.

Princip interference způsobené HAMA

Pozitivní interference je obvykle způsobena můstkovým efektem HAMA nebo heterofilních protilátek (bridging effect), kdy je vytvořen můstek mezi protilátkou na pevné fázi a detekční protilátkou v nepřítomnosti stanovovaného antigenu. Může dojít i k situaci, kdy HAMA zabrání vazbě stanovovaného antigenu na vazebnou a detekční protilátku (negativní interference). Firma Roche používá tři způsoby minimalizace vlivu HAMA:

  • přídavky protilátek blokujících HAMA;
  • fragmentace protilátek v místech náchylných k interferencím;
  • použití chimérických protilátek pro detekci antigenu.

Třetí varianta se týká stanovení Elecsys® TSH, CEA a hs-cTnT.

Charakteristika stanovení hs-cTnT

Metoda stanovení hs-cTnT (Elecsys® Troponin T hs STAT) používá dvě monoklonální protilátky proti lidskému srdečnímu troponinu T. Protilátky rozpoznávají dva epitopy (aminokyselinové pozice 125–131 a 136–147) umístěné v centrální části srdečního troponinu T (288 aminokyselinových zbytků). Interference heterofilních protilátek a HAMA je v této diagnostické soupravě minimalizována pomocí chimérické detekční protilátky (mouse-human chimeric antibody). Výrobce udává, že ani tato specifická vlastnost diagnostické soupravy nemusí úplně vyloučit možnost interference. Na druhé straně je použití chimérické protilátky důvodem pro velmi nízkou frekvenci interferencí, jak dokládá počet dvou dosud popsaných případů u stanovení hs-cTnT.

Situace u ostatních stanovení cTnT a cTnI

Interference HAMA nebo heterofilních protilátek je podle přehledné práce Lippiho3 „almost unpredictable and unsuspected“. Interference se stanovením srdečních troponinů se projevují rozdílně mezi soupravami různých výrobců a vzhledem ke snahám o eliminaci interferencí se jejich výskyt v čase může snižovat. Ne všechny publikované práce popisující možné interference umožňují získání potřebných informací. Chybí buď údaje o použitých diagnostických soupravách, nebo nejsou uvedeny postupy, kterými byla interference potvrzena nebo vyloučená. Tabulka 1 ukazuje publikace 4-124,5,6,7,8,9,10,11,12 popisující vliv suspektních heterofilních protilátek na koncentrace cTnT a cTnI; jsou uvedeny pouze práce, v nichž byly porovnány head-to-head nejméně dvě různé diagnostické soupravy stanovení troponinů a byl současně publikován efekt postupu pro eliminaci vlivu heterofilních protilátek. Frekvence interferencí je vyšší u stanovení cTnI, ale je nutné současně upozornit na fakt, že starší uspořádání diagnostických souprav bylo upravováno s cílem interference minimalizovat. (Tab. 1) 

Tab. 1: Publikace popisující možné interference HAMA nebo heterofilních protilátek při stanovení srdečních troponinů s porovnáním se soupravami bez interferencí. Metody odstranění vlivu heterofilních protilátek: HBR – heterophilic blocking reagent; PEG – precipitace s polyethylenglykolem 6000 (25% w/v) v deionizované vodě; NMS – ošetření séra normálním myším sérem (Sigma – Aldrich Co.); F/PmIgG – F(ab)´2 konjugát a polyklonální myší IgG

Literatura popisující interference heterofilních protilátek při stanovení troponinů není rozsáhlá, Lippi do svého přehledu zahrnul 18 studií, přičemž 17 dalších publikací bylo nutné vyloučit vzhledem k neúplným údajům.3 Často také nejsou uvedeny přesvědčivé výsledky nebo metody pro odstranění vlivu interferentů. Vafaie(1) například popsal vyčerpávající algoritmus pro vyloučení možných interferencí, ale při popisu výsledků čtyř analytických systémů stanovení troponinů neuvedl definitivní potvrzení, nebo vyloučení vlivu heterofilních protilátek. Je také nutné počítat s tím, že HAMA nebo heterofilní protilátky obvykle způsobují pozitivní interferenci, kdežto interference autoprotilátkami vede k falešně negativním výsledkům. Zajímavý postup zvolil Ungerer,11 který porovnával čtyři současně používané systémy stanovení troponinů (Abbott Architect i2000SR Troponin-I STAT; Beckman Coulter Access 2 Enhanced AccuTnI; Roche cobas e 601 Troponin T high sensitivity; Siemens Advia Centaur XP TnI-Ultra) u 2 358 vzorků pacientů a detekoval odchýlené výsledky. Mezi zjištěnými outliers byly jako podezřelé z pozitivní interference označeny vzorky dvou pacientů, u nichž se jako zdroj pozitivní interference označila přítomnost heterofilních protilátek (Beckman Coulter and Siemens cTnI). V tomto experimentu nebyla zjištěna žádná interference HAMA pro hs-cTnT.

Závěry

Předkládaná kazuistika – experimentální pátrání po interferenci, spolupráce mezi laboratoří, klinikou a výrobcem – je příkladem mezioborové spolupráce. Podezření na interferenci při stanovení srdečních troponinů komplikoval fakt, že pacientka mohla, ale také nemusela mít poškození myokardu. Zpočátku nebylo jasné, o jaký typ problému jde, výsledky různých testů a postupů nebyly jednoznačné a pouze použití zkumavek s činidlem blokujícím heterofilní protilátky podstatně zvýšilo oprávněnost suspekce na interferenci, která byla díky spolupráci s výrobcem potvrzena náročnějšími laboratorními testy. Je známou skutečností, že interferující látky reagují různě v různých analytických systémech a s různými analyty. Tato heterogenita je proto důvodem pro použití různých postupů za účelem potvrzení, nebo vyloučení interference. Z praktického hlediska lze doporučit, aby v laboratoři byly k dispozici zkumavky s blokujícím efektem, aby bylo možné ve sporných případech interferenci potvrdit, nebo vyloučit. V každém případě se však na řešení problému obvykle podílí více partnerů a vyústěním této spolupráce je správná péče o informovaného pacienta. 

Poděkování 
Autoři děkují za spolupráci kolegům z firmy Roche v Praze i Penzbergu. 

Prof. MUDr. Antonín Jabor, CSc.

Prof. MUDr. Antonín Jabor, CSc.


MUDr.  Janka Franeková, Ph.D.

MUDr. Janka Franeková, Ph.D.


Literatura
  1. Vafaie M., Biener M., Mueller M., et al. Analytically false or true positive elevations of high sensitivity cardiac troponin: a systematic approach. Heart 2014; 100:508–14.
  2. Lum G., Solarz D.E., Farney L. False positive cardiac troponin results in patients without acute myocardial infarction. Lab Med 2006; 37:546–50.
  3. Lippi G., Aloe R., Meschi T., Borghi L., Cervellin G. Interference from heterophilic antibodies in troponin testing. Case report and systematic review of the literature. Clin Chim Acta 2013; 426:79–84.
  4. Fitzmaurice T.F., Brown C., Rifai N., Wu A.H., Yeo K.T. False increase of cardiac troponin I with heterophilic antibodies. Clin Chem. 1998 Oct; 44(10):2212–4.
  5. Yeo K.T., Storm C.A., Li Y., Jayne J.E., Brough T., Quinn-Hall K.S., Fitzmaurice T.F. Performance of the enhanced Abbott AxSYM cardiac troponin I reagent in patients with heterophilic antibodies. Clin Chim Acta. 2000 Feb 25; 292(1–2):13–23.
  6. White G.H., Tideman P.A. Heterophilic antibody interference with CARDIAC T Quantitative Rapid Assay. Clin Chem. 2002 Jan; 48(1):201–3.
  7. Chan A.O., Chan J.P., Choi K.L., Shek C.C. A patient with an increased troponin level without evidence of ischaemic cardiac injury. Hong Kong Med J. 2004 Aug; 10(4):277–9.
  1. García-Mancebo M.L., Agulló-Ortu o M.T., Gimeno J.R., Navarro-Martínez M.D., Ruíz-Gómez J., Noguera-Velasco J.A. Heterophile antibodies produce spuriously elevated concentrations of cardiac Troponin I in patients with Legionella pneumophila. Clin Biochem. 2005 Jun; 38(6):584–7.
  2. Zhu Y., Jenkins M.M., Brass D.A., Ravago P.G., Horne B.D., Dean S.B., Drayton N. Heterophilic antibody interference in an ultra-sensitive 3-site sandwich troponin I immunoassay. Clin Chim Acta. 2008 Sep; 395(1–2):181–2.
  3. Pernet P., Bénéteau-Burnat B., Hermand C., Vaubourdolle M. Point-of-care testing: false elevation of cardiac troponin I assayed in the emergency department. Am J Emerg Med 2008; 26:969.e1–2.
  4. Ungerer J.P., Marquart L., O'Rourke P.K., Wilgen U., Pretorius C.J. Concordance, variance, and outliers in 4 contemporary cardiac troponin assays: implications for harmonization. Clin Chem 2012; 58:274–83.
  5. Franeková, J., Bláha, M., Bělohoubek, J., Kotrbatá, M., Sečník, P. Jr., Kubíček, Z., Kettner, J., Jabor, A.: A clinical and laboratory approach used to elucidate discordant results of high-sensitivity troponin T and troponin I. Clin Chim Acta, 446, 2015, s. 128–131.
Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.