Preanalytické otázky jsou hlavním zdrojem chyb při vyšetření základních koagulačních testů. Automatizace detekce preanalytických problémů včetně hemolýzy, ikteru a lipemie (HIL), nesprávného objemu plnění odběrových zkumavek a výskytu sraženin je implementována u poslední generace analyzátorů a pomáhá tento problém řešit. Cílem této studie bylo zhodnotit přidanou hodnotu nového preanalytického modulu integrovaného do automatických koagulometrů v porovnání s dosud používanou vizuální kontrolou vzorků.

Úvod

Preanalytické chyby jsou důležitou součástí rutinních laboratorních chyb v koagulaci s mnohdy fatálními důsledky pro správné výsledky laboratorních vyšetření a bezpečnost pacientů. ¹  Základní preanalytické problémy v hemostáze zahrnují nedostatečně naplněné zkumavky, sražené vzorky, hemolyzované, lipemické nebo ikterické vzorky (interference HIL), vzorky odebrané v nevhodných zkumavkách a problémy s identifikací pacientů. Hemolýza je nejčastější příčinou preanalytické neshody. ^2,3  In vitro hemolýza může nastat v důsledku nesprávného odběru vzorků (špatný žilní přístup), nadměrného protřepání vzorku, nevhodné přepravy nebo skladování vzorků. Interference v důsledku hemolýzy vzorku je důsledkem jak analytických, tak biologických variabilit u  vzorku. ⁴  Příčin vzniku hemolýzy může být několik, pokud pomineme patofyziologický stav u  pacienta, pak in vitro hemolýzu může nejčastěji vyvolat pomalý nebo obtížný odběr vzorků, prodloužené zaškrcení paže, použití nesprávných adaptérů při odběru (např. motýlové jehly nebo i. v. katetry) nebo nevhodné jehly (např. jehly s malým průsvitem), dále neúspěšné pokusy najít žílu, nepřiměřené míchání vzorku nebo následně v laboratoři nevhodná manipulace při odstředění vzorku, či nevhodná doprava vzorku (zastaralé systémy potrubní pošty bez kontroly akcelerace rychlosti). Optická interference je způsobena zejména změněnou absorbancí Hb při vlnových délkách běžně používaných optickými analyzátory. Bylo zdokumentováno, že měření pomocí mechanických koagulometrů může být také ovlivněno hemolyzovanými vzorky, protože hermolýza červených krvinek uvolňuje cytoplazmatické a plazmatické membránové molekuly, které interferují s hemostázou. Viditelná hemolýza po centrifugaci je definována jako přítomnost volného Hb v plazmě v koncentraci > 300 mg/dl.⁵

Lipemie, definovaná jako zákal v důsledku zvýšené koncentrace lipidů, je druhou nejčastější endogenní interferující látkou. Často je způsobena parciálním podáváním syntetických lipidových emulzí nebo nedostatečným časem odběru krve po jídle. Zvýšená lipemie ovlivňuje výsledky základních koagulačních testů, zejména D-dimerů, kdy může zásadně ovlivnit optimální klinickou léčbu pacientů. ⁹

Vizuální kontrola jednotlivých vzorků pracovníky laboratoře byla běžnou metodou používanou v minulém desetiletí k detekci preanalytických problémů. ¹⁰  Zvyšující se pracovní zátěž a  potřeba standardizace technologických postupů vedou laboratoře k  zavedení plně automatizovaných analytických systémů. ¹¹  Ačkoli automatizace je už delší dobu běžná v klinické chemii, pro koagulační přístroje byla automatizace preanalytické detekce interference a problémů navržena až u poslední generace přístrojů. ^{12,13,14,15,16,17,18,19,20}

Koagulometry cobas t 511 (Roche) a ACL TOP 750 (Werfen) jsou plně automatizované systémy pro testování hemostázy, které nabízejí preanalytickou kontrolu integrity vzorků pro detekci plazmatických indexů (HIL), nesprávného objemu vzorku a výskytu sraženin.

Cílem této studie bylo srovnání optického koagulačního analyzátoru ACL TOP 750 CTS, každodenně používaného v naší laboratoři, s novým koagulačním analyzátorem cobas t 511, který jako první na  trhu využívá reagenční kazety, jež jsou velmi oblíbené v klinické chemii.

Materiál a metody

Detekce preanalytických parametrů provedená vizuální nebo manuální kontrolou vzorků byla srovnávána s novým preanalytickým modulem integrovaným do automatických koagulometrů cobas t 511 a ACL TOP 750. V rámci posuzování preanalytické fáze byly vyhodnocovány interference hemoglobinu (Hb), bilirubinu a triglyceridů (TG) na vzorcích plazmy obsahující interferující látku ve vysokých koncentracích a byl hodnocen vliv HIL na výsledky základních koagulačních testů PT, aPTT a DDIM.

Přístroj ACL TOP 750 CTS

Plně automatický optický koagulometr s true-walk systémem a plně automatizovanou a uživatelsky defi novatelnou preanalytickou kontrolou vzorků. Díky nejvyšší úrovni výkonu je systém ACL TOP 750 CTS ideální pro jakékoli laboratorní prostředí s velkým objemem zpracovávaných vzorků. Systém ACL TOP 750 maximalizuje jednoduchost, rychlost a produktivitu, zvyšuje automatizaci testování a kvalitu na nejvyšší úroveň. Nyní s automatizovanými preanalytickými kontrolami vzorků a pokročilým automatizovaným řízením kvality systém ACL TOP 750 CTS minimalizuje riziko chyb a  zvyšuje efektivitu zlepšené péče o pacienty.

Přístroj cobas t 511

Přístroj cobas t 511 je společně s větším analyzátorem cobas t 711 prvním koagulometrem na trhu, který využívá reagenční kazety. Koncept reagenčních kazet usnadňuje obsluhu analyzátoru a soft ware kontrolní jednotky umožňuje naprogramovat automatickou přípravu reagencií podle potřeby laboratoře, tzv. Walk Away Reagent Management. Veškeré pozice pro uchovávání reagencií v přístroji jsou chlazené, čímž je zaručena jak velká stabilita reagencií na palubě, tak snížení finančních nákladů. Systémy jsou otevřené a umožňují rovněž použití diagnostik jiných výrobců.

Velmi komfortní funkcí koagulometru cobas t 511 je možnost doplňování vzorků, reagencií a spotřebního materiálu bez nutnosti přerušit nebo zastavit chod přístroje. Automatické testování integrity vzorků (HIL) zvyšuje kvalitu výsledků. Možnost vkládat uzavřené primární zkumavky od různých výrobců minimalizuje riziko kontaminace nebo potenciálního kontaktu s infekčním materiálem ze strany obsluhujícího personálu. Další funkcí, kterou přístroj nabízí, je automatická rotace primárních zkumavek ve stojánku pro načtení čárového kódu.

Vizuální preanalytická kontrola

Doposud byla preanalytická kontrola koagulačních vzorků prováděna vizuálně se subjektivním hodnocením. Snaha o standardizaci postupně vedla k definici škál, a to zejména u hemolýzy. Jak je patrné na obr. č. 3, jednalo se pouze o hrubé zhodnocení možné interference. Nicméně výhodou zavedení škál hodnocení byla standardizace, alespoň v rámci jedné laboratoře.

Automatická preanalytická kontrola

HIL test se provádí kvůli získání přibližné kvantifikace endogenních interferencí. Analyzátor je schopen semikvantitativního měření a hlášení hemolýzy, ikteru a  indexu lipemie. Index hemolýzy (H), index ikteru (I) a index lipemie (L) jsou založeny na výpočtech měření absorbancí zředěných vzorků při různých vlnových délkách. Analyzátor používá k určení indexů HIL samostatnou vyhrazenou testovací aplikaci a kazetu HIL. Analyzátor cobas t 511 používá k detekci hemolyzátu 588 nm.

Rozsah měření testu HIL je 5–100. Hodnoty indexu HIL 100 naznačují následující přibližné koncentrace interferencí:

· H-index 100 ≈ 1 300 mg/dl hemoglobinu

· I-index 100 ≈ 66 mg/dl bilirubinu

· L-index 100 ≈ cca 2 000 mg/dl intralipidu

Testovací specifické interferenční limity pro indexy HIL jsou definovány v e-čárovém kódu každého příslušného testu. Pokud naměřená hodnota indexu HIL překročí horní limit, zobrazí se u daného testu chybové hlášení.

Měření HIL testu může být použito pro jednotlivý vzorek pomocí manuálního zadání, nebo automaticky pro každý vzorek, nebo pouze pro konkrétní test.

Srovnání vizuální kontroly a automatické kontroly vzorků pro jednotlivé preanalytické interferující látky

Vzorky pacientů v naší laboratoři byly cíleně shromažďovány po vizuálním zhodnocení charakteru plazmy. Pro studii byla použita plazma od hospitalizovaných a  ambulantních pacientů jak z  dospělé, tak dětské populace, odebraná do  plastových zkumavek Vacuette obsahujících 3,2% citrát sodný.

Základní koagulační testy zahrnující protrombinový čas (PT), aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT) a D-dimer byly prováděny postupně na  dvou analyzátorech (cobas t 511 a ACL TOP 750). Soubor vzorků o 84 pacientech byl analyzován po zamražení alikvotů při –24 °C. Tyto vzorky jsme před měřením vytemperovali na laboratorní teplotu, promíchali a následně měřili. Další soubor vzorků jsme shromažďovali 8 dnů po sobě, kdy jsme si v rozmezí dopolední pracovní doby (7:00–12:00) všímali vizuálně zajímavých vzorků a ihned měřili jejich preanalytiku jak na ACL TOP 750, tak na cobas t 511 a zjišťovali, kolik námi vizuálně pozitivních vzorků (hemolýza, ikterus, lipemie) je současně pozitivních i na  přístrojích. Všechny vzorky byly analyzovány do 4 hodin po odběru a po  centrifugaci (10 minut, 1 800 g, 20 °C na Jouan C4i).

Interferenční studie na základních koagulačních testech

Pro každou interferující látku (volný hemoglobin, bilirubin nebo triglyceridy) bylo nashromážděno dostatečné množství alikvotů, které jsme po rozmražení paralelně testovali na PT, aPTT, lupus antikoagulans a D-Dimer na každém z analyzátorů cobas t 511 a ACL TOP 750 CTS.

Pro stanovení byla použita srovnatelná diagnostika obou výrobců. V případě testu PT reagencie s  rekombinantními lidskými tromboplastiny, u  testu aPTT reagencie s oxidem křemičitým a se syntetickými fosfolipidy ( aPTT SP, Werfen) a se směsí sójových fosfolipidů (aPTT screen, Roche), u testu citlivého na lupus antikoagulans reagencie dRVVT (dilute Russel viper venom time, Werfen) a  reagencie aPTT lupus obsahující kyselinu ellagovou a  směs mozkových králičích a sójových fosfolipidů (Roche) a pro test D-dimer diagnostika druhé generace s kombinací dvou monoklonálních protilátek.

Výsledky

Srovnání vizuální kontroly a kontroly vzorků pomocí automatického hodnocení preanalytiky bylo provedeno na 1 435 vzorcích z běžného provozu laboratoře. Vizuální nebo manuální kontrola zjistila statisticky více vzorků s preanalytickými problémy než preanalytický modul integrovaný v automatických koagulometrech Roche cobas t 511 a ACL TOP 750 CTS (2,65 % vs. 0,84 %, p > 0,001).

Většina vzorků s  preanalytickou interferencí byla odmítnuta kvůli hemolýze vzorku (2,37 % po  vizuální kontrole, resp. 0,56 % u  automatického hodnocení preanalytických pravidel, p < 0,001). Oba typy hodnocených automatických analyzátorů s integrovanými preanalytickými moduly, tedy jak cobas t 511, tak ACL TOP 750 CTS, shodně označily 12 vzorků (0,84 %) překračujících limity preanalytických interferujících látek, oproti tomu vizuální kontrola detekovala 38 pozitivních vzorků (2,65 %). Ikterické vzorky byly detekovány ve shodném počtu preanalytickými moduly analyzátorů jako při manuálním stanovení (0,07–0,14 % vs. 0,14 %, p NS), stejně tak lipemické vzorky (0,14 % vs. 0,14 %, p NS). Zásadní rozdíl byl v hodnocení hemolýzy, kde bylo při manuálním hodnocení nalezeno 34 pozitivních vzorků oproti 8, resp. 9 vzorkům z automatických preanalytických systémů (2,37 % vs. 0,56–0,63 %, p < 0,001).

Interferenční studie základních koagulačních testů

Stanovení základních koagulačních testů bylo porovnáváno na skupině 67 pacientů s manuálně vyhodnocenou interferencí v preanalytické fázi vyšetření, kdy pomocí využití automatického hodnocení preanalytické fáze bylo dosaženo redukce odmítnutí vzorků v rozsahu 57–85 % dle typu stanovení.

Při hodnocení jednotlivých testů byla vždy hodnocena korelace hodnot pomocí směrnice a odchylky.

Souhrn

Vizuální nebo manuální kontrola zjistila statisticky více vzorků s preanalytickými problémy než nové preanalytické moduly integrované na cobas t 511, resp. ACL TOP 750 (3,5 % vs. 6,6 %, p <0,001). 

Většina preanalytických chyb vznikla v důsledku špatného plnění odběrového systému. Interference ve formě hemolýzy, ikteru a lipemie (HIL) se projevily při jednotlivých testech, když koncentrace volného hemoglobinu, bilirubinu nebo triglyceridů překročily prahovou hodnotu, která byla specifická pro analyzátor a použitou diagnostickou soupravu.

Závěr

Automatická a standardizovaná kontrola rutinních koagulačních vzorků pomocí cobas t 511, resp. ACL TOP 750, zvýšila přesnost a konzistenci při detekci preanalytických otázek ve srovnání s vizuální kontrolou. Hlavní výhodou je automatická detekce preanalytických chyb a odstranění subjektivního hodnocení těchto parametrů, což vedlo ke značné redukci preanalytických chyb.

Diskuse

Preanalytické moduly s automatizovanou spektrofotometrickou detekcí pro interferenci HIL a s nástroji kontrolujícími objem naplnění primární náběrové zkumavky včetně výskytu mikrosraženin jsou nově vyvinuté technologické inovace pro zlepšení kvality vyšetřovaného materiálu v procesu testování hemostázy. Naším cílem bylo zhodnotit vliv zavedení automatického hodnocení preanalytické fáze oproti doposud užívanému subjektivnímu hodnocení možného preanalytického ovlivnění výsledku.

Při posuzování jsme se zaměřili pouze na hodnocení hemolýzy, ikteru a lipemie (HIL). Nehodnotili jsme výskyt špatně naplněných zkumavek a výskyt mikrosraženin, jelikož na našem pracovišti se tyto problémy vyskytují v minimální míře.

U hodnocení HIL jsme byli příjemně překvapeni. Na rozdíl od implementace v klinické chemii, kde preanalytické systémy vedou k zvýšenému odmítání vzorků, v koagulaci se naopak počet vzorků s interferencemi snížil. To je asi zásadní věc pro implementaci automatického hodnocení preanalytické fáze do koagulace, jelikož každý vzorek, který je nutné opakovat, nám opožďuje možnost reagovat na potenciálně krvácivý stav u pacienta.