Patologie je věda o nemocech, jejich příčinách, mechanismech, diagnostice, vývoji, komplikacích. Patologie slouží živým, napomáhá jiným oborům medicíny stanovit správnou diagnózu a nastínit směr léčby. Neslouží jen k pitvám zemřelých, což je přes strmý rozvoj tohoto oboru stále převažující názor veřejnosti...

Kam směřuje dnešní patologie?

Dnešní patologie se zabývá především hodnocením vzorků tkání od živých pacientů, ať už odebraných při operacích, excizích nebo endoskopicky (gastroskopie, kolonoskopie, ERCP, hysteroskopie atd.). Jak ukazují nejnovější zkušenosti předních světových pracovišť, v budoucnu se budou v patologii prohlubovat imunohistochemické metody a metody molekulární genetiky. Jsou to metody sice dražší, ale diagnosticky přesnější. Patologové se stále více uplatňují rovněž při peroperační diagnostice, to znamená, že provádějí diagnózu i v průběhu operace ze zmražené tkáně. Další šance dává molekulární genetika. Ta se zabývá prokazováním mechanismů nádorových onemocnění na molekulární úrovni. Rovněž se věnuje geneticky podmíněným chorobám (např. nádory prsu, některé nádory tlustého střeva a plic – u nás nejčastější onkologická onemocnění). Stanovení prediktivních markerů nádorů na molekulární úrovni je navíc bezpodmínečně nutné pro nasazení tzv. cílené biologické léčby.

Co je to imunohistochemie (IHC)?

Imunohistochemie je histologická barvicí metoda, při níž se ve vzorku tkáně prokazuje přítomnost určitých molekul – antigenů – pomocí specifických protilátek s navázanými barevnými koncovkami. Takto lze např. rozlišit některé typy buněk či ověřit chorobné změny.

Krátce k historii…

Imunohistochemie (IHC) se rozvíjela jako jedna z modernějších metod přibližně od 30. let 20. století na hranici histologie, analytické chemie a biochemie. Jejím cílem je identifikovat a lokalizovat chemické látky v místě jejich výskytu v tkáních. Základem pro IHC byla možnost vazby molekul imunoglobulinů s jinými molekulami  
v buňkách, což si lze představit jako situaci zámku a odpovídajícího klíče. Do patologické diagnostiky se tyto techniky dostávaly od 50. let a postupně byla zlepšována specificita, senzitivita a dostupnost stále širšího spektra metod, k čemuž napomohl i rozvoj molekulárního a genového inženýrství, nezbytný pro výrobu reagencií k této metodě. V 70. letech 20. století byly připraveny protilátky proti jednomu konkrétnímu místu ve tkáni (antigenní determinantě), tzv. monoklonální protilátky. Tyto protilátky jsou dnes široce používány při IHC vyšetření zejména ve větších patologických laboratořích, které mají v nabídce desítky až stovky druhů protilátek.

Jak se IHC v praxi používá…

Lékaři operačních oborů odeberou z těla pacienta část nemocné tkáně nebo celé patologické ložisko. Provádějí to buď při otevřené operaci, při endoskopickém vyšetření, nebo punkcí. Takto získaný vzorek tkáně je odeslán na oddělení patologie, kde ho lékaři a laboranti zpracují a zhotoví mikroskopický preparát. Patolog pak vzorek hodnotí v mikroskopu. IHC v patologii používáme u tkáňových řezů fixovaných ve formaldehydu (formalínu)  
a zalitých v parafínu. Jsou to tedy vzorky tkání od pacientů zpracované stejným postupem jako u běžného histopatologického vyšetření. Tím vzniká možnost jednotného odběru tkáně i zpětného vyšetřování vzorků již dříve odebraných.

K čemu je IHC dobrá…

V současnosti je role IHC v diagnostické praxi u řady chorob prakticky nezastupitelná. V dnešní době se patologie soustřeďuje zejména na diagnostiku nádorových onemocnění. Dokážeme z preparátu určit, zda jde o nádorové, či nenádorové ložisko, stanovit biologickou povahu a histologický typ nádoru či stupeň jeho zhoubnosti. IHC umožňuje získat o vzorku mnohem přesnější informace, což má zásadní význam pro pacienta. U některých typů nádorů dokážeme zjistit, jakou lze použít protinádorovou léčbu či jak jsou nádory na tuto léčbu citlivé.  

Většina u nás prováděných biopsií pochází z oddělení chirurgie, gynekologie, dermatologie, na vzestupu jsou odběry z oddělení gastroenterologie.V mnoha případech představuje IHC vyšetření v dnešní době nepodkročitelné minimum, abychom pacientům mohli poskytovat vyšetření na úrovni odpovídající současným poznatkům medicíny. Bioptických vzorků přibývá, na našich pracovištích v Prostějově a Přerově ročně vyhodnotíme přibližně 18 000 biopsií (pro srovnání ve FN Olomouc cca 30 000 biopsií ročně). Speciální vyšetřovací metody, jako je IHC a molekulární genetika, se centralizují do velkých laboratoří, které kromě moderního vybavení disponují i týmem odborníků pro jednotlivá odvětví patologie.  

Imunohistochemická barvicí metoda byla na pracovištích patologie Prostějov, Přerov, Šternberk v rámci SMN a.s. zavedena v 1/2015. Po dobu 1/2015–12/2016 byla všechna vyšetření prováděna manuálně za použití vodní lázně k demaskování antigenu a výhradně s protilátkami firmy Dako ve formě koncentrátů či RTU (ready-to-use). V prosinci 2016 naše pracoviště přešlo na automatický provoz na přístroji Ventana BenchMark Ultra firmy Roche. Při nastavení protokolů barvení jednotlivých protilátek se ukazuje, že hladkosvalový aktin SMA klon 1A4 firmy Dako (koncentrát ředěný 1:100, monoklonální myší) přes použití různých ředění i délky inkubace vykazuje falešnou pozitivitu barvení jader buněk a značné přibarvení pozadí – testováno na tkáni tlustého střeva, viz obr. 1a. Na rozdíl od protilátky SMA klon 1A4 firmy Roche (RTU, monoklonální myší), kde tento negativní fenomén mizí, viz obr. 1b. 

Dostali jsme příležitost vyzkoušet i další klon SMA SP171 dodávaný firmou Roche jako koncentrát (produkovaný její dceřinou firmou Spring Bioscience).

Protokol barvení koncentrátem SMA SP171

Dodaný zkušební vzorek koncentrované protilátky SMA SP171 (králičí, monoklonální) jsme podrobili analýze na 3 testovaných tkáních: tlusté střevo, apendix, tonzila. Použili jsme níže uvedený protokol barvení ve 3 sestupných koncentracích: 1:200 (doporučená firmou Roche), 1:250 a 1:500. Sledované parametry zahrnují (viz tabulka 1): 

1. Intenzitu barvení buněk hladké svaloviny
2. Výskyt a intenzitu nežádoucího přibarvení pozadí
3. Výskyt falešně pozitivního barvení tkání jiného původu

Protokol nastavení v automatu byl u všech koncentrací stejný:

1. Sušení – zahřátí skla na 60 °C, inkubace 4 minuty
2. Demaskování antigenu  – ULTRA Conditioner CC1 (pH 8,6), teplota 90 °C, 36 minut (mild)
3. Titrace – ruční aplikace primární protilátky, inkubace 20 minut (37 °C) 
    

Výsledky jsou shrnuty v tabulkách č. 1 a dále ilustrovány pořízenou fotodokumentací (obr. č. 2).

Diskuse

Pro zkoumání optimální koncentrace protilátky SMA SP171 jsme použili dvě tkáně, které nejčastěji používáme v běžném provozu jako pozitivní kontrolu pro většinou námi používaných protilátek: apendix a tonzilu. V apendixu je silná vrstva hladké svaloviny, tedy předpokládáme výraznou expresi SMA. Naopak v tonzile je struktur obsahujících hladkou svalovinu podstatně méně, tedy předpokládáme ověření, zda i v nízké koncentraci protilátky tyto komponenty spolehlivě zobrazíme. Třetí tkání byl polyp tlustého střeva, kde prokazujeme kontinuitu vrstvy m. mucosae pro vyloučení mikroinvaze u high grade lézí. Právě u této tkáně jsme po zavedení barvení IHC na automatu zjistili falešnou pozitivitu jader enterocytů při použití protilátky XY. 

Vyhodnocením 10 vzorků polypů, apendixů a tonzil – vždy od jiného pacienta – jsme zjistili následující:

1. Žádný vzorek v žádné z koncentrací 1:200, 1:250, 1:500 nevykazuje falešnou pozitivitu. Tento výsledek je 100% s hodnotou falešné pozitivity rovné 0.
2. U všech tkání je ve všech koncentracích uspokojivá síla exprese protilátky SMA, která se snižující se koncentrací jen lehce klesá (hodnoceno v 5bodové škále, kdy 5 = max, 0 = min): 
   • 1:200 je intenzita barvení u jednotlivých tkání v průměru: 4,3 – 4,4 – 3,6 
   • 1:250 je intenzita barvení u jednotlivých tkání v průměru: 3,9 – 4,6 – 3,8 
   • 1:500 je intenzita barvení u jednotlivých tkání v průměru: 3,2 – 3,8 – 3,0
3. Přibarvování pozadí, které je nežádoucí, strmě klesá se snižující se koncentrací protilátky (hodnoceno v 5bodové škále, kdy 5 = max, 0 = min): 
   • 1:200 je přibarvení pozadí u jednotlivých tkání v průměru: 2,8 – 3,1 – 1,9 
   • 1:250 je přibarvení pozadí u jednotlivých tkání v průměru: 1,4 – 1,6 – 1,3 
   • 1:500 je přibarvení pozadí u jednotlivých tkání v průměru: 0,6 – 0,6 – 0,2

Závěr

Protilátka SMA SP171 (koncentrát firmy Roche) použitá v automatu Ventana BenchMark Ultra firmy Roche nevykazuje falešnou pozitivitu. Barvení je dostatečně průkazné jak v ředění 1:200 doporučeném firmou, tak v ředěních nižších, a to až 1:500. V barvení 1:200 se lehce přibarvuje pozadí, což je vidět na pořízených snímcích. Naopak v ředění 1:500, kdy je intenzita barvení SMA+ struktur stále dostatečná, zůstává pozadí čisté. V neposlední řadě je toto zjištění výhodné i z hlediska ceny protilátky.