article main title
Zavedení fluorescenční imunohistochemie pomocí manuální metodiky a automatu BMK Ultra na pracovišti MDgK-plus
Dana Střítecká 1 , doc. MUDr. Josef Feit, CSc. 1 , Lucie Jeřábková, DiS. 1 , MUDr. Jarmila Klusáková, PhD. 2 , RNDr. Jaroslav Loucký 1,3 , PharmDr. Aleš Zima, Ph.D. 4
1) MDgK-plus spol. s r.o.
2) MDgK-plus spol. s r.o., Brno
3) Imalab s.r.o., Zlín
4) MDgK - plus, spol. s r.o., člen skupiny Vaše laboratoře s.r.o., U Lomu 638, Zlín

Historie

Obr. 1: Princip fluorescenčního mikroskopu (CC-BY-SA Autor: Henry Mühlpfordt: Cc-by- sa-3.0,2.5,2.0,1.0, GFDL, der. Vojtěch Dostál) 

Imunohistochemie (IHC) začala pronikat do lidského povědomí během čtyřicátých let dvacátého století. Jedná se o jednu z modernějších metod vycházející z histochemie, která vznikala přibližně od třicátých let dvacátého století. Cílem IHC je lokalizovat a identifikovat chemické látky ve tkáních na histologické nebo cytologické úrovni. Ve čtyřicátých letech dvacátého století se zdařil první průkaz antigenů ve tkáni, od padesátých let se tyto techniky začaly dostávat i do diagnostiky v rámci oboru patologie a postupně byly vylepšovány. V sedmdesátých letech byly připraveny protilátky proti jednomu konkrétnímu epitopu (antigenní determinantě), tzv. monoklonální protilátky. Významné bylo rovněž spojení enzymu s protilátkou, jehož praktické využití vyústilo v širší zavedení IHC do praxe.   
IHC je v dnešní době využívána ke specifičtějšímu průkazu látek v preparátech, k upřesnění onkodiagnostiky, k lokalizaci extra- či intracelulárních molekul, enzymů, sekrečních produktů apod. V diagnostické praxi je IHC u řady chorob prakticky nezastupitelná. Specifickou variantou IHC je imunofluorescenční vyšetřovací metoda, která od roku 1960 zaznamenala velké rozšíření a zdokonalení.

Fluorescenční mikroskopie umožňuje zobrazit určité látky obsažené v buňkách často v minimálním množství. Je založena na skutečnosti, že některé chemické látky – fluorofory (známé i pod názvem fluorochromy či fluorescenční barviva) – po dopadu světla o kratší vlnové délce (excitační záření) září světlem o delší vlnové délce (emisní záření), tzn. světlem jiné barvy. Tento jev se nazývá fluorescence a je projevem intramolekulové energetické změny vzbuzené v látce absorbovaným zářením. Podstatou fluorescence je tedy použití vysoce citlivého fluoroforu v kombinaci se specifickou primární protilátkou. Fluoroforem může být malá molekula, například typicky organická sloučenina s aromatickým jádrem, popřípadě protein. Výhodou je vysoká citlivost a možnost pozorovat několik znaků pomocí fluoroforů s rozdílnou emisí. Fluorofor bývá nejčastěji kovalentně připojen k makromolekule, kde ho lze detekovat. Takovými makromolekulami mohou být například protilátky, nukleové kyseliny nebo peptidy. Mezi nejznámější fluorofory patří například fluorescein isothiocyanát (FITC, zelený fluorofor) nebo fluorofory derivované od rhodaminu (TRITC s červenou výslednou fluorescencí), dále fluorofory derivované od kumarinu nebo cyaninu. Nové generace fluo-roforů jsou zpravidla účinnější než tradiční fluorofory se srovnatelnou excitací a emisí. Jsou stabilnější na světle, jasnější a méně pH senzitivní. 

K vyhodnocení výsledků fluorescenčního barvení se používají fluorescenční mikroskopy, které se od světelných podstatně liší vybavením. 

Základní součástí fluorescenčního mikroskopu jsou: 

Zdroj světla: ze světelného zdroje vychází světlo s různými vlnovými délkami od ultrafialové po infračervenou. 
Excitační filtr: tento filtr propouští pouze světlo, které je potřebné k fluorescenci vzorku, obvykle především s kratší vlnovou délkou. Ostatní světlo pohlcuje. 
Fluorescenční preparát: vzorky, které za použití fluoroforu reagují na dopadající světlo fluorescencí. 
Bariérový filtr: pohlcuje všechno excitační světlo, které nebylo použito k excitaci, a propouští pouze fluorescenční světlo. Navíc je možné z fluorescenčního spektra nechat projít pouze jeho část. 

Funkce fluorescenčního mikroskopu je založena na dvou principech: 

1. Na vzorek dopadá pouze světlo v intervalu vlnových délek, které způsobují excitaci. 
2. K vytvoření obrazu je využita pouze nezbytně nutná část fluorescenčního světla, které obsahuje i neabsorbovanou část excitačního světla. Obraz se buď pozoruje „online“ v mikroskopu, nebo se nafotí a prohlíží pomocí počítače. Volba vlnové délky je velmi podstatná, stejně jako použití vhodných optických filtrů.

A jak to funguje v praxi?

Molekuly protilátky (lépe monoklonální) označené navázaným fluoroforem se specificky vážou s molekulami buněčných a tkáňových antigenů – vznikají komplexy antigen + protilátka + fluorofor. Tyto při použití patřičného filtru v mikroskopu fluoreskují, čímž nám dávají informaci o přítomnosti antigenu v buňce či tkáni. 

Imunofluorescenční vyšetření tedy slouží jednak k detekci antigenů v tkáních či buňkách, jednak umožňuje průkaz protilátek. Díky tomu rozlišujeme dva typy IF – přímou a nepřímou. 

Přímá imunofluorescence detekuje pomocí značených protilátek antigeny přítomné v buňkách a tkáních. 

Nepřímá imunofluorescence informuje o přítomnosti specifických protilátek v séru pacienta. Diagnostika probíhá za použití substrátu (např. opičí jícen), který je nanesen na speciální podložní skla, na nichž dochází k navázání značené protilátky proti sérovým protilátkám pacienta. 
Fluorofory jsou navázány na polyklonální nebo monoklonální protilátky, které interferují s antigenem. V praxi se využívají komerčně vyráběné konjugáty – fluoroforem označené protilátky: prasečí imunoglobuliny konjugované FITC proti lidskému imunoglobulinu IgG, IgA, IgM, Ig – polyklonální, proti 3. složce komplementu (C3) a fibrinu, lehkým a těžkým řetězcům (Kappa, Lambda). 

Imunofluorescenční metodikou lze provést kompletní diagnostiku imunokomplexových onemocnění i onemocnění, která vzniknou na podkladě tvorby protilátek proti vlastním orgánům, jejich částem a organelám – tzv. autoagresivní choroby. U komplexových onemocnění detekujeme nepřímo imunokomplexy ve tkáních, kapiláry glomerulů u glomerulonefritid, cévy u artritid. Sérologicky v řezech prokazujeme protilátky proti hladké svalovině, mitochondriím, štítné žláze, buňkám žaludeční sliznice, myokardu, bazálním membránám plicních alveolů, glomerulárním bazálním membránám atd. Lze detekovat viry, jejich nahromadění v buňce, jádře, jadérku. Můžeme verifikovat některé bakterie a některé zvláštní proteiny s charakteristickými antigenními vlastnostmi – gliální proteiny, myosin, amyloid a jiné. U nádorů z lymforetikulární tkáně lze detekovat jejich příslušnost k T nebo B řadě. 

Obr.2: PrestoChill                                              Obr. 3: Příprava kryopreparátů                             Obr. 4: Příprava kryopreparátů
Obr. 6: BMK Ultra
Obr. 7: Skla pro barvení IF v BMK Ultra
Obr. 5: Kryostat

 

Obr. 8: Sklo pro vyšetřování séra metodou nepřímé imunofluorescence 

V naší laboratoři jsme zavedli do praxe imunofluorescenční (IF) vyšetření autoimunitních dermatologických onemocnění za využití přímé fluorescence. 

Co se týče technického zpracování kožních biopsií, je nezbytné dodržovat určité zásady odběru a transportu tkáně ke zpracování. V rámci naší laboratorní příručky jsme informovali potenciální odběrová pracoviště o všech nezbytných krocích. Tkáň se ke zpracování do laboratoře transportuje v tzv. nativním, nefixovaném stavu, nikoliv fixovaném ve formolu, jak tomu bývá u standardních biopsií. Abychom mohli garantovat kvalitní výsledek vyšetření, je bezpodmínečně nutné tkáň bezprostředně po odběru uložit na gázu navlhčenou fyziologickým roztokem do transportní uzavíratelné nádobky a následně vložit nejlépe do termosky s chladicím médiem. V žádném případě nesmí být tkáň ponořena do jakékoliv tekutiny (např. fyziologický roztok), mohlo by dojít k poškození tkáně a ztížení diagnostiky. Aby byl výsledek kvalitní, je rozhodující i doba od odběru do zmrazení tkáně. Kůže obsahuje méně enzymů, což umožňuje určitou časovou rezervu, nicméně včasné zmrazení tkáně je pro kvalitu vyšetření nejdůležitějším kritériem.

Laboratoř MDgK-plus zakoupila pro účely rychlého zmrazování tkání – ať už pro fluorescenční vyšetření nebo peroperační biopsie – přístroj PrestoChill. V tomto přístroji zmrazíme tkáň za použití vhodného kryomédia během jedné minuty na teplotu -40 °C. Obrovskou výhodou tohoto postupu je zamezení tvorby krystalů ledu a tím vzniku mrazových artefaktů. Díky tomuto faktu dosáhneme v podstatě stejné kvality kryopreparátu, s jakou se setkáváme při zpracování konvenční histologie u FFPE preparátů (preparáty formolem fixované a zalité do parafínu). Další výhodou je možnost orientace vzorku – po seřezání podložky pod tkání získáme zásluhou techniky „lícem dolů“ rovnou plochu tkáňových struktur. 

Dalším krokem je zhotovení kryořezů. Naše laboratoř je vybavena vysoce výkonným kryostatem s intuitivním softwarem a dotykovou obrazovkou pro jednoduchý a efektivní provoz. Komoru lze vychladit na teplotu až -35 °C. Disponuje 27 úložnými pozicemi pro vzorky, integrovaným zařízením rychle ochlazuje na teplotu -55 °C ± 2 °C. Umožňuje zhotovit kvalitní řezy o tloušťce 3–4 µm. 
Pro jedno vyšetření zhotovujeme celkem 7 skel, a to systémem postupného prořezání vzorku pro vyšetření IgA, IgG, IgM, C3, fibrinogenu plus 2 skla s volnými řezy jako případnou rezervu. 

Skla uložíme do skleněné kyvety, kterou pečlivě obalíme parafilmem a necháme při 4 °C do druhého dne. Poté preparáty barvíme dvojí metodou: 

- manuálně – po revitalizaci fyziologickým roztokem aplikujeme protilátku a inkubujeme ve vlhké komoře 60 minut při pokojové teplotě (RT). Následuje 3x 5minutový oplach ve fyziologickém roztoku. Pro kontrast barvíme 1% roztokem Evans Blue (váže se na plazmatické bílkoviny). Skla necháme při RT v temnu úplně uschnout a montujeme médiem pro fluorescenční barvení, které jsme si na našem pracovišti pro tyto účely vyrobili. Jeho výhodou je výrazně vyšší stabilita fluorescenčních barev. Proces barvení trvá cca 2 hodiny. 

- automaticky v IHC barvicím automatu Ventana BenchMark Ultra (BMK Ultra) – preparáty revitalizujeme ve 4 °C chlazeným acetonem, opláchneme reagenčním pufrem, opatříme štítky a vložíme do automatu. Barvení fluorescenčním kitem trvá cca 15 minut. Po skončení barvení opláchneme opět pufrem, dobarvíme Evans Blue a důkladně opláchneme reakčním pufrem. Po úplném zaschnutí zamontujeme. BMK Ultra nám poskytuje tu velkou výhodu, že proces je krátký a bez nároků na zásah obsluhy. Další výhodou je, že celý proces barvení probíhá v uzavřeném automatu pod krytem opatřeným tmavým sklem, který fotosenzitivní protilátky maximálně chrání. 

Obě metodiky (manuální a pomocí barvicího automatu) jsou v laboratoři MDgK-plus v současné době prováděny paralelně v rámci optimalizace metody a výběru nejvhodnějšího postupu. Po vyhodnocení výsledků za určité období bude vybrán pouze jeden postup, který bude následně používán rutinně. 

Dalším způsobem fluorescenčního vyšetření je metoda fluorescenčního vyšetření z FFPE řezů. Má více výhod: jednak si imunofluorescenční vyšetření můžeme indikovat sami pro doplnění nebo upřesnění diagnostiky z preparátů FFPE, jednak pacient nemusí podstupovat opakovaný odběr, protože fluorescenční vyšetření se provede z jeho tkáně odebrané pro histologické vyšetření. A v neposlední řadě odpadá riziko poškození nativní tkáně jejím transportem. 

Z parafínových bloků zhotovíme řezy a necháme je do druhého dne sušit v termostatu. Po deparafinaci revitalizujeme PBS pufrem. Demaskování antigenu provádíme enzymaticky. Používáme stejné fluorescenční protilátky jako u kryořezů s inkubací v termostatu. Ke kontrastnímu dobarvení používáme rovněž Evans Blue. Montujeme do média pro fluorescenční barvení. Vzhledem k vysoké fotosenzitivitě fluorescenčních protilátek je důležitou podmínkou eliminace světla během celého barvicího procesu. 
Tato metoda je sice časově náročná, ale její přínos je nesporný. 

V současné době jsme u nás v laboratoři MDgK-plus začali rovněž testovat metodu vyšetřování sér pacientů pomocí nepřímé imunofluorescence. Tuto metodu nyní zatím používáme pouze pro dermatologickou diagnostiku, tzn. jen s použitím protilátky IgG. 
Speciální podložní sklo s 5 vybroušenými jamkami a s adhezivním povrchem (viz obr. 8) se substrátem necháme vytemperovat na RT a následně komůrku s jícnem zaplníme vyšetřovaným sérem zředěným PBS pufrem. Inkubujeme ve vlhké komoře 30 minut při RT. Následuje nejprve důkladný oplach pufrem a poté zalití komůrky pufrem na 5 minut. Dalším krokem je aplikace IgG protilátky ředěné PBS pufrem. Inkubace probíhá 30 minut ve vlhké komoře při RT, tentokrát ve tmě. Po oplachu pufrem dobarvujeme pro kontrast roztokem Evans Blue a po dalším oplachu montujeme do média pro fluorescenční barvení. 
Vzhledem k jednoduchosti vyšetření i minimální invazivitě pro pacienta předpokládáme výrazný zájem ze strany kliniků. 

IF vyšetření v dermatopatologii se týká především těchto diagnóz: 

Pemphigus vulgaris – zde se vážou autoprotilátky C3 a IgG v oblasti desmosomů (obr. 9) 
Porphyria cutanea tarda – lupusový anti-IgG pruh v junkční zóně a vakovité dilatace cév s depozity IgG, C3 a fibrinu ve stěnách (obr. 10 a obr. 11) 
Dermatitis herpetiformis Duhring – IgA protilátky granulárně uspořádané v papilách dermis v sousedství puchýřků (obr. 12) 
Lupus erythematosus – přítomnost IgG, C3, IgA a IgM v oblasti dermoepidermální junkce (obr. 13) 
Bulózní pemphigoid – charakterizován přítomností IgG a C3 v oblasti bazální membrány epidermis (obr. 14) 
Imunokomplexová vaskulitida – charakterizována depozity protilátek ve stěnách cév (obr. 15) 

Obrázky 9–15 pocházejí z Atlasu dermatopatologie: www.muni.cz/atlases 

Obr. 9: Pemphigus vulgaris                                                                  Obr. 10: Porphyria cutanea tarda – cévy
Obr. 11: Porphyria cutanea tarda – potní žlázky a cévy  Obr. 12: Dermatitis herpetiformis Duhring   Obr. 13: Lupus erythematosus                                     
Obr. 14: Bulózní pemphigoid                                                                    Obr. 15: Imunokomplexová vaskulitida   
Dana Střítecká

Dana Střítecká


doc. MUDr. Josef Feit, CSc.

doc. MUDr. Josef Feit, CSc.


Lucie Jeřábková, DiS.

Lucie Jeřábková, DiS.


MUDr. Jarmila Klusáková, PhD.

MUDr. Jarmila Klusáková, PhD.


RNDr. Jaroslav Loucký

RNDr. Jaroslav Loucký


PharmDr. Aleš Zima, Ph.D.

PharmDr. Aleš Zima, Ph.D.


Absolvent VFU FaF Brno, kde do roku 2010 v rámci svého Ph.D. studia působil na Ústavu přírodních léčiv. V rámci doktorské práce se zabýval biologickou aktivitou přírodních látek. V laboratorní diagnostice pracuje od roku 2010. V letech 2014–2017 působil v Roche Diagnostics na obchodní a aplikační pozici zejména v oblastech patologie a molekulární biologie. Nyní pracuje jako obchodní ředitel skupiny laboratoří vaselaboratore.cz a jako provozní ředitel histopatologické laboratoře MDgK - plus, spol. s r.o., jež je součástí zmíněné skupiny.

Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.