Za podpory firmy Roche byly vypracovány na Oddělení klinické hematologie Ústavu laboratorní diagnostiky fakultní nemocnice Ostrava dvě bakalářské práce studentů Lékařské fakulty Ostravské univerzity. Výsledky první z nich byly zveřejněny v minulém čísle časopisu Labor Aktuell 2/2019. Druhá práce, kterou stručně shrnujeme následujícím textem, se zabývala porovnáním koagulačních analyzátorů cobas t 511 a Sysmex CS-5100.

Úvod

Laboratorní diagnostika přináší pro klinickou medicínu stěžejní informace. Díky laboratorním výsledkům je lékař schopen blíže klasifikovat případnou patologii a vytvořit optimální diagnostický a léčebný plán. V současné době je na trhu k dispozici velký výběr různých typů koagulačních analyzátorů, které se liší svými výkonnostními charakteristikami a funkcemi, tj. rozsahem měření, mezí detekce, mezí stanovitelnosti, robustností, reprodukovatelností, automatickou kontrolou vzorků na HIL, funkcí propichování uzávěrů zkumavek, sofistikovaným programem QC s možností nastavení Westgardových pravidel a dalšími. Pro běžnou klinickou praxi je důležité, aby byla zachována obecná mezipřístrojová porovnatelnost výsledků, tedy porovnatelnost výsledků napříč laboratořemi. Tato práce se zaměřila na porovnání analyzátoru cobas t 511 a Sysmex CS-5100 z hlediska výkonu, principů testů, managementu reagencií a kontrolních materiálů. Cílem práce byl také pohled na preanalytickou kontrolu vzorků, opakovatelnost měření v sérii a porovnání výsledků fyziologických i patologických pacientských vzorků (u testů PT, aPTT, TT, FBG, AT a DDi). Pro oba analyzátory byla zajištěna účast v externím hodnocení kvality laboratoří (SEKK).

Použité přístroje

Koagulační analyzátor Sysmex CS-5100 je využíván pro měření rutinních koagulačních testů na Oddělení klinické hematologie Ústavu laboratorní diagnostiky ve Fakultní nemocnici Ostrava. Firma Roche Diagnostics s.r.o. půjčila bezplatně za účelem zpracování bakalářské práce koagulační analyzátor cobas t 511. Na obr. č. 1 je zobrazen koagulační analyzátor firmy Roche cobas t 511. Jedná se o plně automatizovaný koagulační analyzátor založený na optickém principu měření, který je určen k diagnostickému použití pro analýzu koagulačních, chromogenních a imunoturbidimetrických metod ve středních či velkých klinických laboratořích.

Tento analyzátor je schopen zpracovat až 195 PT/aPTT testů za hodinu. Dle typu testů provádí měření při čtyřech vlnových délkách (408, 588, 625 a 800 nm) a na palubu lze umístit až 57 reagenčních kazet. Analyzátor jako jediný na trhu umožňuje automatickou rekonstituci reagencií díky systému reagenčních kazet, na rozdíl od konkurenčních výrobců, kteří reagencie dodávají v samostatných lahvičkách. Tento prvek výrazně minimalizuje nutnost manuálních zásahů při obsluze analyzátoru. Dalším významným inovativním prvkem je chlazený zásobník na reagencie, který je součástí analyzátoru. Na obr. č. 2 je zobrazen koagulační analyzátor Sysmex CS-5100. Jedná se opět o plně automatizovaný koagulační analyzátor, který je určen k diagnostickému použití pro analýzu koagulačních, chromogenních, imunoturbidimetrických a agregačních metod ve velkých klinických laboratořích. Tento analyzátor je schopen zpracovat až 400 PT/aPTT testů za hodinu, systém umožňuje měřit při pěti vlnových délkách (340, 405, 575, 660 a 800 nm), maximálně lze analyzovat 60 parametrů a nabízí měření v normálním i tzv. mikrorežimu. Inovativní prvek tohoto analyzátoru představuje možnost stanovení agregačních i koagulačních metod pouze na jedné analytické platformě. Koagulační analyzátor Sysmex CS-5100 byl v rámci této studie veden jako referenční vzhledem k tomu, že se jedná o rutinně používaný koagulační analyzátor na OKH ve Fakultní nemocnici Ostrava. Pracovní rozmezí jednotlivých testů jsou uvedena v tab. č. 1. Přístroj cobas t 511 umožňuje měřit u PT základní i tzv. prodlouženou dobu měření (E). Analyzátor CS-5100 nabízí prodlouženou dobu měření pro PT i aPTT. U vysokých koncentrací DDi nabízí oba přístroje měření po naředění plazmy (D). U ostatních porovnávaných testů je pracovní rozmezí podobné.

Firmy Roche s.r.o. (dále jen Roche) i Siemens Healthcare s.r.o. (dále jen Siemens) nabízejí pro vybrané testy několik různých typů reagencií lišících se svým složením. Pro tuto studii byly vybrány od fy Roche tzv. screeningové reagencie. Na analyzátoru Sysmex CS-5100 jsou dlouhodobě používány reagencie Siemens, vyhovující požadavkům OKH. Složení reagencií pro stanovení PT i aPTT je uvedeno v tab. č. 2. Tab. č. 3 uvádí vliv jednotlivých interferujících látek na stanovení PT a aPTT. Stabilita obou reagencií pro stanovení PT po rekonstituci je 5 dní. U aPTT pak má delší stabilitu po rekonstituci Pathromtin SL (14 dní) ve srovnání s aPTT Screen (5 dní).

Složení reagencií pro stanovení TT a FBG a vliv interferujících látek je popsán v tab. č. 4 a č. 5. Stabilita všech reagencií po rekonstituci je 5 dní. Stanovení AT je založeno na chromogenním principu měření, reagencie AT firmy Roche využívá lidský FIIa, reagencie Innovance Antithrombin firmy Siemens lidský FXa (viz tab. č. 6). V literatuře se uvádí, že se výsledky mohou lišit v důsledku vlivu rozdílné síly vazby FIIa či FXa na AT. Reagencie pro stanovení DDi se liší typem používané monoklonální protilátky (viz tab. č. 6). Tab. č. 7 uvádí vliv jednotlivých interferujících látek na stanovení AT a D-Di2. Stabilita všech reagencií pro oba testy je 28 dnů po prvním použití.

Metodika

Vzorky byly analyzovány na Oddělení klinické hematologie Ústavu laboratorní diagnostiky ve Fakultní nemocnici Ostrava v období 12/2018–04/2019. Datový soubor obsahoval 858 pacientských vzorků od fyziologických až po silně patologické. Žilní krev byla odebírána do zkumavek značky Sarstedt s 3,2% citrátem sodným. Plazma byla připravována centrifugací po dobu 7 minut při 2 500 g a následně vyšetřena na obou analyzátorech, tj. cobas t 511 a CS-5100. Grafické a statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí statistického softwaru MedCalc, verze 18.2.1 (Passing-Bablokova regresní analýza, Bland-Altmanův rozdílový diagram). Některé vzorky musely být vyloučeny z důvodu výrazně odlehlých hodnot nebo proto, že nebyl vydán výsledek z jednoho či druhého analyzátoru. Uvedené vyhodnocení bylo doplněno o deskriptivní statistiku. Nakonec byl proveden výpočet procentuálních odchylek měření Di (%), které byly porovnány s povolenými odchylkami měření Dmax (%) uváděnými firmou SEKK.

Výsledky a diskuse

Vyhodnocení výsledků pacientských vzorků

Protrombinový test vyjádřený jako mezinárodní normalizovaný poměr (PT-INR) byl stanoven celkem na 817 vzorcích. Z tohoto množství bylo pro vyhodnocení použito 799 vzorků. Hodnota indexu citlivosti (ISI) byla 0,939 u používané šarže reagencie PT Rec, resp. 0,92 pro Dade Innovin. Čím je hodnota ISI blíže jedné, tím je daná reagencie citlivější vůči mezinárodnímu tromboplastinu BCT67/40. Tab. č. 8 popisuje deskriptivní statistiku a regresní analýzu PT-INR. Procentuální odchylky měření byly u 100 % porovnávaných dvojic výsledků menší než deklarovaná hodnota (D_MAX = 20 %), viz obr. č. 4. Byla zjištěna dobrá shoda ve výsledcích PT-INR mezi analyzátory Sysmex CS-5100 a cobas t 511 (viz obr. č. 3), což potvrzuje i vysoká hodnota korelačního koeficientu (0,973). Aktivovaný parciální tromboplastinový test vyjádřený jako poměr (APTT-R) byl měřen celkem na 692 vzorcích. Z tohoto množství bylo k vyhodnocení použito 667 vzorků. Tab. č. 9 popisuje deskriptivní statistiku a regresní analýzu APTT-R. Procentuální odchylky měření byly u 100 % porovnávaných dvojic výsledků menší než deklarovaná hodnota (D_MAX = 20 %), viz obr. č. 6. Byla zjištěna dobrá shoda ve výsledcích APTT-R mezi analyzátory Sysmex CS-5100 a cobas t 511 (viz obr. č. 5), což opět potvrzuje i vysoká hodnota korelačního koeficientu (0,970).

Trombinový test vyjádřený jako poměr (TT-R) byl změřen celkem na 461 vzorcích, z tohoto množství bylo k vyhodnocení použito 450 vzorků. Passing-Bablokův diagram na obr. č. 7 ukazuje na relativně vysokou heterogenitu dat a odklon od linearity. Tab. č. 10 popisuje deskriptivní statistiku a regresní analýzu TT-R. Procentuální odchylky měření byly u 95,1 % porovnávaných dvojic výsledků menší než deklarovaná hodnota (D_MAX = 20 %), viz obr. č. 8.

Rozdíly byly pravděpodobně způsobeny různými koncentracemi trombinu u používaných reagencií (Sysmex CS-5100 obsahuje 2,5 IU/mL trombinu a cobas t 511 obsahuje 2,0–10,0 IU/mL trombinu). Z tohoto důvodu je porovnání výsledků TT-R problematické. Heterogenitu výsledků potvrdil i relativně nízký korelační koeficient (0,516).

Fibrinogen (FBG) byl měřen celkem na 545 vzorcích, z tohoto množství bylo k vyhodnocení použito 534 vzorků (viz obr. č. 9 a 10). Tab. č. 11 popisuje deskriptivní statistiku a regresní analýzu FBG. Procentuální odchylky měření byly u 100 % porovnávaných dvojic výsledků menší než deklarovaná hodnota (D_MAX = 25 %), viz obr. č. 10. Byla zjištěna velmi dobrá shoda ve výsledcích FBG mezi analyzátory Sysmex CS-5100 a cobas t 511 (viz obr. č. 9), což potvrzuje i vysoká hodnota korelačního koeficientu (0,986).

Antitrombin (AT) byl měřen celkem u 207 vzorků, k vyhodnocení bylo z tohoto množství použito 197 vzorků. Tab. č. 12 popisuje deskriptivní statistiku a regresní analýzu AT. Procentuální odchylky měření byly u 99,49 % porovnávaných dvojic výsledků menší než deklarovaná hodnota (D_MAX = 25 %). Dobrou shodu ve výsledcích AT mezi analyzátory Sysmex CS-5100 a cobas t 511 (obr. č. 11) potvrzuje i vysoká hodnota korelačního koeficientu (0,924). I přes rozdíly ve složení reagencií (Roche FIIa vs. Siemens FXa) není stanovení AT klinicky ani statisticky ovlivněno.

D-dimery (DDi) byly měřeny celkem na 288 vzorcích, k vyhodnocení bylo z tohoto množství použito 276 vzorků. Passing-Bablokův diagram na obr. č. 13 ukazuje na patrný odklon od linearity s rostoucí koncentrací DDi. Tab. č. 13 popisuje deskriptivní statistiku a regresní analýzu výsledků DDi. Procentuální odchylky měření byly u necelých 37 % výsledků (N = 101) větší než deklarovaná hodnota (D_MAX = 27 %). Korelace výsledků není u stanovení DDi optimálním řešením jako u předešlých metod. Lze využít možnost srovnání, zda je výsledná hodnota testu DDi hodnocena jako pozitivní či negativní dle cut-off hodnoty (0,50 mg/L FEU pro oba analyzátory). Podle tohoto srovnání pod cut-off hodnotou bylo 34 % (N = 93) výsledků z analyzátoru Sysmex CS-5100, resp. 44 % (N = 122) výsledků z analyzátoru cobas t 511. Porovnání výsledků DDi je obecně problematické z důvodu rozdílného typu používaných protilátek v reagenciích, nicméně zjištěný korelační koeficient (0,966) je relativně vysoký.

Opakovatelnost měření v sérii

Jedním z dalších cílů práce bylo porovnání hodnot variačních koeficientů mezi analyzátory v rámci tzv. opakovatelnosti měření v sérii. Pro účely tohoto porovnání byl použit vybraný fyziologický vzorek, který byl postupně změřen na obou analyzátorech šestkrát po sobě (N = 6). Průměrné hodnoty výsledků (X), velikosti směrodatných odchylek (SD), variační koeficienty (CV) a přípustné variační koeficienty udávané výrobci (CV_MAX) jsou uvedeny v tab. č. 14. Vypočítané variační koeficienty (CV) všech sledovaných parametrů splňují při měření za podmínek opakovatelnosti v sérii limity dané výrobci obou analyzátorů (CV_MAX).

Nejistota měření

Pro výpočet rozšířených kombinovaných nejistot měření byly použity výsledky analýz firemních atestovaných kontrolních materiálů firmy Roche (Con N, Con 1) a Simens (Control N, DDIM 1) a kontrolních materiálů cyklu HKG4/18 (B) firmy SEKK, resp. DD4/18 (A) firmy Ecat. Výsledky byly vyhodnoceny v softwaru SLP. Všechny vypočítané hodnoty rozšířených kombinovaných nejistot jsou menší než limitní hodnoty Dmax dle SEKK (tab. č. 15).

Externí hodnocení kvality

Na obou přístrojích byly proměřeny vzorky externího hodnocení kvality cyklu Hemokoagulace – HKG1/19 firmy SEKK. Výsledky byly hodnoceny v rámci stejnorodých skupin uspořádaných podle použitých reagencií. Vzhledem k tomu, že je potřeba minimálně 5 členů ve skupině, nebyly pro analyzátor cobas t 511 hodnoceny testy APTT (APTT-R) a TT (čas, ratio). Certifikát prokazující úspěšnost výsledků byl získán pouze pro fibrinogen, antitrombin, protrombinový test (INR), protrombinový test (ratio). Systému EHK se zúčastnil i analyzátor Sysmex CS-5100, který byl úspěšně hodnocen ve všech testech. Celkový přehled výsledků porovnávaného analyzátoru cobas t 511 včetně certifikátu a osvědčení o účasti viz obr. č. 15, 16 a 17.

Závěr

I přes rozdílné složení reagencií a specifické provozní možnosti obou koagulačních analyzátorů cobas t 511 a Sysmex CS-5100 byla zjištěna velmi dobrá mezipřístrojová porovnatelnost výsledků PT, aPTT, FBG a AT. Závěry statistického a grafického vyhodnocení svědčí o vysoké korelaci mezi výsledky, a to i v oblastech velmi patologických hodnot. Mezi výsledky TT a DDi byla zjištěna nižší míra mezipřístrojové porovnatelnosti. U TT je toto pravděpodobně způsobeno rozdílnými koncentracemi trombinu (2,5 IU/mL vs. 2,0–10,0 IU/mL) a u DDi odlišným typem monoklonálních protilátek proti D-dimerům. Zjištěné rozdíly mezi analyzátory, které jsou popsány v tomto článku, mohou být přínosné pro personál laboratoří, aplikační specialisty a také vývojáře obou firem. Bylo prokázáno, že analyzátor cobas t 511 splňuje požadavky na kvalitní a přesnou laboratorní diagnostiku.