Clostridioides difficile (CD) je najčastejšou príčinou postantibiotických hnačiek a ich dôležitosť stúpa najmä v súvislosti s nozokomiálnymi infekciami. Infekcie spôsobené Clostridioides difficile (CDI, z angl. Clostridioides difficile infection) majú podľa údajov v literatúre stúpajúci trend a v období pandémie COVID-19 je tento vzostup akcelerovaný nadmernou preskripciou antibiotík. Závažnosť CDI stúpa s vekom a početnosťou recidív.

Diagnostika CDI a interpretácia výsledkov prináša v klinickej praxi veľa zložitých situácií. Relevantnosť výsledkov môže byť modifikovaná neadekvátnou indikáciou alebo nesprávnou manipuláciou so vzorkou stolice. Všeobecne platí, že na diagnostiku CDI je nutné zvoliť kombináciu minimálne dvoch diagnostických testov. Dôvodom kombinácie testov je ich rozdielna prediktívna hodnota, citlivosť a možná falošná negativita najmä pri stanovení toxínov s ohľadom na ich termolabilitu. Použitie metódy PCR komplikuje otázka kolonizácie netoxigénnymi kmeňmi CD. Vzhľadom na tepelnú nestálosť klostrídiových toxínov by mala byť vyšetrovaná stolica spracovaná bezodkladne. Ak nie je možné túto stolicu vyšetriť ihneď, mala by byť skladovaná pri teplote 5 °C.

Pri vytváraní diagnostických algoritmov možno využiť kombináciu nasledujúcich testov:

Dôkaz klostrídiového antigénu – glutamátdehydrogenáza (EIA)

Glutamátdehydrogenáza (GDH) je špecifický exoenzým produkovaný kmeňmi CD. Rovnako ako dôkaz toxínov je táto metóda založená zväčša na „enzyme immunoassay“ (EIA). Stanovenie GDH je ideálnym testom na vylúčenie CDI, jeho vysoká negatívna prediktívna hodnota s vysokou pravdepodobnosťou vylučuje prítomnosť CD. Zároveň na základe pozitivity GDH nie je možné odlíšiť toxigénne a netoxigénne kmene CD.

Dôkaz klostrídiových toxínov A/B (EIA)

Stanovenie toxínov metódou EIA má s prihliadnutím na ich termolabilitu nižšiu citlivosť oproti stanoveniu GDH. Pri pozitívnom výsledku ma vysokú pozitívnu prediktívnu hodnotu v stanovení CDI.

Stanovenie génov kódujúcich toxíny CD (PCR)

Real-time PCR stanovenie génov kódujúcich toxíny CD sa postupne dostáva do rutinnej laboratórnej praxe a to nielen ako konfirmačný, ale aj skríningový test. Okrem extrémnej citlivosti tejto metodiky (99–100 %) je výhodou rýchla dostupnosť výsledkov, poprípade stanovením typických delécií je možné určiť najčastejšie hypervirulentné kmene CD. Vysoká citlivosť testu obmedzuje jeho skríningové použitie. Test je natoľko citlivý že zachytí aj minimálne množství toxigénnych CD. Tento fakt znižuje jeho pozitívnu prediktívnu hodnotu. Pri skríningovom vyšetrení je nutné test kombinovať s EIA stanovením toxínov CD.

Anaeróbna kultivácia CD

Kultivácia CD je prístrojovo, časovo a finančne náročná metodika. Tvorba spór CD vytvára priestor na kultiváciu po ich vyklíčení aj po dlhšom čase. Konfirmáciu kultivačného nálezu možno realizovať množstvím metód od latex aglutinačných cez biochemické, až k moderným metodikám ako MALDI-TOF alebo PCR. Náročnosť tohoto procesu predurčuje kultiváciu CD na konfirmačný test, nie ako skríningový. Výhodou kultivácie je možnosť stanovenia citlivosti CD na antibiotiká.

Dôkaz cytotoxicity na tkanivových kultúrach

Dôkaz cytotoxicity na tkanivových kulturách je konfirmačným vyšetrením v malom množstve laboratórií vzhľadom na náročnosť metodiky nielen z pohľadu vybavenia laboratória, ale aj hodnotenia výsledkov.

Stratégia diagnostiky CDI

Každá z metodík popísaných vyššie má svoje výhody a zároveň svoje slabiny. Vytvorené algoritmy diagnostiky CDI kombinujú jednotlivé metodiky so snahou maximálne využiť silné stránky testov a zároveň eliminovať ich slabiny. Zo správnej kombinácie testov profituje nielen pacient, ale aj zdravotnícke zariadenie liečiace pacienta. Pri tvorbe algoritmov zohráva dôležitú úlohu nielen presnosť výsledku, cena testu, ale aj doba dostupnosti výsledku. Skúšky cytotoxicity a kultiváciu CD s ohľadom na časovú náročnosť možno použiť len na doplnkovú – rozšírenú diagnostiku. Real-time PCR bola donedávna ťažšie dostupná a drahá metóda, čo ju významne eliminovalo pri jej použití v algoritmoch diagnostiky CDI. Posledné obdobie sme svedkami nevídaného pokroku pri použití molekulárnych metód v medicínskej praxi, čo nám poskytuje priestor na častejšie použitie PCR v diagnostike CDI. Dostupnosť POCT PCR v praxi významne znižuje časové okno na potvrdenie pravdepodobnej infekcie CDI.

POCT PCR v diagnostike klostrídiovej kolitídy

POCT analyzátory (z angličtiny point of care testing) sú laboratórne prístroje určené na diagnostiku pacienta v mieste vyšetrenia/liečby pacienta. Ich využite na urgentních príjmoch alebo jednotkách intenzívnej starostlivosti už má svoju tradíciu. Pandémia COVID-19 ukázala dôležitosť POCT v skorej identifikácii pacienta s infekčnou chorobou a správnom manažmente pacienta vrátane karanténnych opatrení.

Extrémna citlivosť POCT real-time PCR je výhodou aj slabosťou tejto metodiky. Ako je uvedené v tabuľke 1, PCR diagnostika má vyššiu citlivosť oproti stanoveniu GDH. PCR dokáže zachytiť už minimálny počet toxigénnych kmeňov CD, a tak je na jednoznačné potvrdenie CDI nutné doplniť aj vyšetrenie toxínov EIA. Pri použití iba PCR testu bez doplňujúceho testu podľa algoritmov sme vystavení riziku falošnej pozitivity na podklade kolonizácie tráviaceho traktu CD. U pacienta s pozitívnou PCR, ale negatívnym toxínom, je nutné v diagnostike CDI zohľadniť aj klinický stav pacienta, rizikovú anamnézu a laboratórny nález, popřípadě zvážiť rektoskopické vyšetrenie.

Priemerná dostupnosť laboratórnych výsledkov je za ideálnych podmienok menej ako 18 hodín. Moderné POCT prístroje dokážu stanoviť výsledok vrátane odberu do pol hodiny. Praktické trvanie testu však závisí od organizácie práce pracoviska, množstva zaškoleného personálu a umiestnenia prístroja. Pri použití v ambulancii je popisovaný čas najkratší.

Problém ekonomickej výhodnosti POCT PCR je nutné analyzovať nielen z pohľadu jednotkovej ceny testu, ale najmä vo vzťahu k umiestneniu POCT PCR v algoritme diagnostiky. Trojstupňový algoritmus (GDH + Toxín EIA+PCR) je ekonomicky nevýhodný, a oproti dvojstupňovému s PCR testom (PCR + toxín EIA) významne nezvyšuje citlivosť algoritmu. V porovnaní dvojstupňových algoritmov s PCR (PCR + toxín EIA + PCR) a bez neho (GDH + toxín EIA), je test z ekonomického pohľadu výhodnejší, avšak menej senzitívny. Finančná výhoda pri skorej diagnostike s nastavením adekvátnej liečby karanténnych opatrení so zabránením ďalších nozokomiálnych nákaz bola publikovaná v množstve prác. Jednoduchá obsluha a skorá dostupnosť výsledku významne zjednodušuje určenie správnej diagnózy liečby a ďalšieho postupu.

Aj z našej praktickej skúsenosti pri validácii metodiky cobas® Cdiff Nucleic acid test pre cobas® Liat® System sme sa presvedčili o vysokej citlivosti testu. Vyšetrili sme 6 pacientov s prítomnými hnačkami po liečbe antibiotikami. Všetkým pacientom bol súčasne realizovaný dôkaz GDH a klostrídiových toxínov imunoenzymaticky. Zo 6 vyšetrení bola CDI vylúčená u 2 pacientov (negatívne POCT PCR, súčasne negatívne GDH a dôkaz toxínov EIA), u 2 bola s PCR pozitivitou potvrdená pozitivita GDH aj toxínov EIA. U 2 pacientov sme CDI suponovali s ohľadom na klinickú symptomatológiu a typický laboratórny nález, pričom imunoenzymatické vyšetrenie toxínov bolo opakovane negatívne.

POCT PCR bolo u oboch pozitívne, pričom u jedného pacienta bola CDI verifikovaná aj rektoskopickým vyšetrením. Po nasadení liečby vankomycínom došlo u všetkých 4 pacientov k zlepšeniu stavu, zníženiu frekvencie hnačiek a poklesu zápalovej aktivity.

Skorá a správna identifikácia nie je kľúčová len pri ochorení COVID-19, ale aj pri CDI. Pri zavádzaní metodiky do praxe je preto nutné zohľadniť nielen citlivosť testu, ale aj rýchlosť dostupnosti výsledku. Na základe skorého určenia správnej diagnózy, adekvátnej liečby a karanténnych opatrení vychádza na prvý pohľad drahšia metodika nakoniec ako výhodnejšia, s významnou úsporou finančných nákladov.