V prvním kvartálu tohoto roku byl uveden test pro stanovení celkových protilátek proti Treponema pallidum v lidském séru a plazmě na všech platformách založených na měřicím principu elektrochemiluminiscence, tedy na systémech Elecsys^® 2010, Modular^® ANALYTICS, cobas e 411 a cobas e 601/e 602. Před uvedením tohoto testu na trh byly provedeny na četných skupinách probandů multicentrické studie, jejichž výsledky jsou součástí příbalového letáku a o nichž jsme vás již informovali v předchozích vydáních časopisu Labor Aktuell a také pomocí jiných informačních kanálů. Vzhledem k tomu, že bývá dobrým zvykem si dané parametry ověřit i na lokální úrovni a rovněž se podrobněji seznámit se specifiky dané imunochemické metody, požádali jsme tři významná pracoviště v České republice reprezentující jiný zákaznický segment z hlediska odbornosti i typu organizace. Touto cestou bychom si jim také dovolili poděkovat za vstřícnost, skvělou spolupráci a invenci. V následujících částech budou postupně probrány jejich zkušenosti.

1) Zhodnocení testu Elecsys^® Syphilis na analyzátoru cobas^® 6000 – OHKT ÚVN Praha

Pplk. MUDr. Miloš Bohoněk, Ph.D., Ing. Ludmila Landová, Ph.D., MUDr. Hana Zákoucká, Bc. Eliška Sládková, Dana Horčičková 
Oddělení hematologie a krevní transfuze, Ústřední vojenská nemocnice – Vojenská fakultní nemocnice Praha 

Během studie bylo na Oddělení hematologie a krevní transfuze ÚVN Praha vyšetřeno 200 negativních sér dárců krve z OHKT ÚVN Praha a 61 pozitivních sér zapůjčených z Národní referenční laboratoře pro syfilis (SZÚ). Celkem 200 negativních sér bylo vyšetřeno v den 0 (následující den po odběru) na analyzátoru Galileo pomocí hema-glutinační metody Immucor TPHA ScreenTM a současně na analyzátoru cobas^® 6000 (na modulu e 601) metodou Elecsys^® Syphilis (ECLIA). Následně byly vzorky odeslány do Národní referenční laboratoře pro syfilis a vyšetřeny na analyzátoru Architect i2000 metodou Syphilis TP (CMIA). Další den (den 1) tamtéž byly vzorky opakovaně vyšetřeny na analyzátoru Architect i2000 a odeslány zpět do ÚVN Praha pro opakované stanovení na analyzátorech Galileo a cobas^® 6000 (tab. 1). 
Dále pak 61 pozitivních sér zapůjčených z Národní referenční laboratoře bylo vyšetřeno všemi konfirmačními metodami v NRL používanými, tj. VDRL, TPPA, TPHA, FTA-ABS IgG, FTA-ABS IgM, 19S IgM SPHA a také na Architect i2000. V den 0 (den doručení do ÚVN Praha) a den 1 (následující den) byly vzorky vyšetřeny na analyzátoru cobas^® 6000 metodou Elecsys^® Syphilis (tab. 2). Nakonec jsme testovali také samostatnou skupinu 20 falešně pozitivních vzorků z NRL. Vzorky byly vyšetřeny na analyzátoru cobas^® 6000 s negativním závěrem (tab. 3).  

Na základě provedené studie můžeme konstatovat, že výsledky získané testem Elecsys^® Syphilis jsou plně srovnatelné se současnými specifickými IgG testy pro stanovení syfilis a přináší tak nové možnosti pro automatizaci screeningu protilátek proti syfilis u dárců krve. Metoda pro screening syfilis Elecsys^® Syphilis na analyzátoru cobas^® 6000 je vhodná pro rutinní vyšetření dárců krve a krevních složek i pro vyšetření pacientů.

2) Zkušenosti z testování metody Elecsys^® Syphilis v mikrobiologické laboratoři fakultní nemocnice

MUDr. Jana Bednářová, Ph.D., Mgr. Krystyna Kantorová  
Oddělení klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Brno 

Na Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno bylo v rutinním provozu v měsících květnu a červnu roku 2014 vyšetřeno na analyzátoru cobas e 411 celkem 327 vzorků, z toho 240 negativních a 87 pozitivních. Iniciálně pozitivní séra byla vyšetřena duplicitně. U všech vzorků byla sledována příslušná shoda/neshoda naměřených výsledků s dalšími technologiemi a typy metod, a sice netreponemovou metodou RPR firmy Omega a treponemovým hemaglutinačním testem prove-nience BioRad. V případě nesouhlasných interpretací dosažených těmito metodami, zejména pak BioRad TPHA, nebo ve speciálních případech indikovaných kliniky se přistoupilo k dalšímu prověřovacímu a konfirmačnímu testování, což je vidět v přiložených tabulkách. K tomuto byly použity tyto soupravy ELISA: EIA Treponema pallidum IgG, EIA Treponema pallidum IgM (firmy TestLine) a Western blot: T. pallidum IgG Marblot Strip Test System, T. pallidum IgM Marblot Strip Test System (společnosti MarDx Diagnostics Inc., Trinity Biotech). Jak je vidět níže, tabulka 4 ukazuje zjištěné neshody u negativních sér metodou Elecsys^® Syphilis a tabulka 5 pak shrnuje nalezené rozpory ve výsledcích u opakovaně reaktivních vzorků testem Elecsys^® Syphilis. Pod každou z tabulek jsou tyto rozpory v hodnocení podrobněji rozebrány a je také definován závěrečný komentář pro každý z případů. 

Vzorky č. 1544, 1891 
Jde o dva pacienty se slabě pozitivními IgM v testu ELISA, všechny ostatní testy (RPR, TPHA, ELISA IgG, u pacienta 1891 rovněž Western blot IgG, Western blot IgM) negativní. Bez anamnestických či klinických údajů svědčících pro syfilis. 
Závěr: Pravděpodobně falešná reaktivita IgM v testu ELISA. 

Vzorek č. 1721 
Jde o pacienta se sporným výsledkem TPHA, všechny ostatní testy (RPR, ELISA IgG, ELISA IgM, Western blot IgG, Western blot IgM) negativní. Bez anamnestických či klinických údajů svědčících pro syfilis. 
Závěr: Pravděpodobně falešná reaktivita TPHA. 

Vzorky č. 1296, 1614, 1617, 1830 
Jde o pacienty ve věku 3 týdny až 3 měsíce, u nichž došlo k pasivnímu přenosu protilátek třídy IgG během gravidity z matky na plod. Tyto protilátky jsou po porodu po určitou dobu detekovatelné v krvi dítěte, odkud jsou postupně eliminovány. U všech čtyř pacientů byly v době vyšetření na analyzátoru cobas e 411 detekovány protilátky v nižších hodnotách (v rozmezí 2,76–8,00), ze stejného odběru bylo u těchto pacientů TPHA již negativní, z dalších treponemových testů bylo u dvou pacientů pozitivní stanovení IgG metodou Western blot a u dalších dvou pacientů byl výsledek vyšetření IgG metodou Western blot hraniční. 
Závěr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacientů s pasivně přenesenými anti-treponemovými protilátkami. 

Vzorky č. 1439, 1690, 1712 
Jde o pacienty, kteří prodělali laboratorně i klinicky potvrzenou syfilis v roce 2009, resp. 2011 a 2013. U všech tří pacientů dochází k postupnému „slábnutí“ reakce TPHA – v době vyšetření byla reakce TPHA u všech tří pacientů pouze sporná, výsledek na analyzátoru cobas e 411 byl pozitivní (hodnoty 9,83; 6,59 a 55,93). 
Závěr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacientů s dříve prodělanou infekcí. 

Vzorek č. 1489 
Jde o pacienta se sporným výsledkem reakce TPHA, ELISA IgG pozitivní, Western blot IgG pozitivní. Stejný laboratorní výsledek TPHA, ELISA a Western blot byl detekován již v roce 2013, bez dalších známých anamnestických údajů. Sérologický nález odpovídá dříve prodělanému onemocnění syfilis, postupné „slábnutí“ reakce TPHA. 
Závěr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacienta s dříve prodělanou infekcí. 

Vzorky č. 1526, 1553 
Dva vzorky od téhož pacienta odebrané s odstupem 2 dnů. Jde o pacienta s čerstvým onemocněním syfilis, z obou vzorků RPR 1 : 4 a TPHA negativní, z druhého vzorku doplněny testy ELISA a Western blot – ELISA IgG pozitivní, Western blot IgG pozitivní, IgM hraniční. 
Závěr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacienta s čerstvou syfilis. 

Vzorek č. 1496 
Jde o HIV+ pacienta s negativním RPR a TPHA, výsledek na analyzátoru cobas e 411 byl nízce pozitivní (hodnoty 2,01, resp. 2,11). Z dalších testů pouze Western blot IgG hraniční. Dle anamnézy se v minulosti v Praze léčil pro syfilis. Protilátková odpověď může být ovlivněna základním onemocněním (HIV+). 
Závěr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacienta s dříve prodělanou infekcí. 

Vzorek č. 1587 
Jde o pacienta s negativním výsledkem RPR a TPHA v základním screeningu, na základě výsledků z analyzátoru cobas e 411 doplněny konfirmační testy, zde ELISA IgG pozitivní, Western blot IgG pozitivní. Sérologický nález odpovídá dříve prodělanému onemocnění syfilis. 
Závěr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacienta s dříve prodělanou infekcí. 

Vzorek č. 1770 
Jde o pacienta s negativním výsledkem RPR a TPHA v základním screeningu, na základě výsledků z analyzátoru cobas e 411 doplněny konfirmační testy, ELISA negativní, Western blot negativní. Bez dalších známých anamnestických údajů stran syfilis. 
Závěr: Vzhledem k negativitě všech sérologických testů (RPR, TPHA, ELISA, Western blot) pravděpodobně nejde o onemocnění syfilis. Nelze vyloučit falešnou pozitivitu testu cobas e 411, blíže se však ke srovnání obou testů nelze vyjádřit. 

Vzorek č. 1791 
Přestože jde o kontakt od pacienta č. 1526, 1553 s čerstvou syfilis, byly výsledky všech testů negativní (RPR, TPHA, ELISA, Western blot). Klinický stav pacienta t. č. nesvědčí pro onemocnění. 
Závěr: Vzhledem k udávanému kontaktu s pozitivním pacientem a současně negativnímu výsledku všech sérologických testů se ke srovnání obou testů nelze blíže vyjádřit. 

Z uvedených výsledků a závěrů vyplývá, že test Elecsys^® Syphilis představuje rychlý a spolehlivý způsob detekce specifických antitreponemových protilátek v časných i pozdních fázích infekce. Ve srovnání s tradičními precipitačními a aglutinačními metodami minimalizuje riziko falešně negativních výsledků v časné fázi infekce a umožňuje jednoznačnou interpretaci výsledků ve všech fázích onemocnění.

3) Ověřování vlastností a využití automatizované metody Elecsys^® Syphilis v moderní soukromé laboratoři

Mgr. Andrea Dolinová, Ph.D., RNDr. Jaroslav Loucký  
IMALAB s.r.o. Zlín 

Laboratoř IMALAB zajišťuje široké spektrum vyšetření pro klinické specialisty Zlínského kraje, přičemž oblast sérologie je poměrně četně zastoupenou indikací. Tato laboratoř velmi úzce spolupracuje s centrem prenatální diagnostiky a genetiky PREDIKO, s.r.o., a s IVF centrem reprodukční medicíny, pro které provádí mj. screeningová vyšetření těhotných, kde vyšetření treponemových a netreponemových protilátek hraje svou nezastupitelnou roli. Výhoda automatizovaného a časově neomezeného stanovení napomáhá ke zlepšení organizace práce a umožňuje tak dodávat komplexní informace klinikům v mnohem kratším čase. Na tomto pracovišti byla testována zejména vhodnost soupravy pro rutinní provoz z hlediska stability. Reagenční kit byl založen po dobu 6 týdnů na palubě analyzátoru cobas e 411, přičemž byl uskladňován v lednici pouze o víkendech. Každý den byla prováděna kontrola kvality prostřednictvím kontrolního materiálu Elecsys^® PreciControl Syphilis na jedné hladině, výjimečně na obou hladinách.

Pro jednotlivá stanovení kontroly kvality byly použity příslušné jednorázové alikvóty, které byly připraveny z příslušných lyofilizátů. Naměřené hodnoty kontrol jsou znázorněny na níže uvedeném obrázku 1 a demonstrují stabilní chování soupravy v čase, které překračuje minimální deklarovanou stabilitu na palubě, uvedenou v příbalovém letáku (28 dní). Po celou dobu používání soupravy nebylo nutné soupravu rekalibrovat. V případě negativní kontroly se hodnotí QC dle tzv. target range (rozmezí cílových hodnot), které je stanoveno v tomto případě v rozmezí COI = 0-0,3, což odpovídá povaze této kvalitativní (semikvantitativní) metody. Průměr našich 29 měření této hladiny č. 1 docílil hodnoty 0,132. Pozitivní kontrola je již nastavena na klasickou cílovou hodnotu COI = 5,29 s deklarovanou 1SD = 0,53, přičemž náš průměr z 27 měření představoval COI = 4,76 se zjištěnou 1SD = 0,31. Dovolujeme si připomenout, že správnost měření pacientů je garantována firmou, pokud se QC v tentýž den nalézá v rozmezí 5,29 ± 3SD. 

V rámci získávání zkušeností s tímto kitem byly změřeny rovněž vzorky externí kontroly kvality ze Státního zdravotního ústavu a výsledky byly porovnány s ELISA soupravou PATHOZYME^®SYPHILIS Competition výrobce Omega Diagnostics, která se v době testování soupravy Elecsys v místní laboratoři používala. Vyhodnocení treponemového testu (Omega Diagnostics) bylo provedeno na základě změřené cut-off kontrolního vzorku, který byl součástí IVD soupravy. Vzorky s OD450 menší než cut-off kontrolního vzorku byly považovány za pozitivní, hodnoty vyšší než cut-off kontrolního vzorku byly negativní. Výsledky byly rovněž potvrzeny kvantitativně netreponemovým RPR testem a byly ve shodě s hodnocením SZÚ. Měření kontrolních vzorků metodou Elecsys^® Syphilis bylo provedeno v duplikátech. Za pozitivní byly považovány výsledky COI ≥ 1. Dosažené výsledky shrnuje tabulka 6. 

Díky laskavosti představitelů Transfuzního a tkáňového oddělení FN Brno-Bohunice, jmenovitě primářky MUDr. Evy Tesařové a RNDr. Evy Křížové, Ph.D., bylo možné přeměřit vzorky dárců s opakovaně reaktivními výsledky, stanovené původně systémem Abbott Architect i2000. Z důvodu těchto výsledků byly vzorky dárců v roce 2009 vyřazeny a uchovány v zamraženém stavu. V tabulce 7 jsou rovněž závěry výsledků konfirmace ze SZÚ, se kterými jsou výsledky metody Elecsys^® Syphilis ve shodě. Bylo provedeno opakování v duplikátu jednak pro ověření preciznosti stanovení a jednak pro potvrzení počátečně reaktivních vzorků (COI ≥ 1). 

V září letošního roku jsme zavedli metodu Elecsys^® Syphilis do rutinního provozu, čímž jsme udělali další krok ke zvýšení úrovně našich služeb poskytovaných klinikům a k nárůstu efektivity práce naší laboratoře.