article main title
Stanovení 25-hydroxyvitaminu D inovovanou metodou Elecsys® Vitamin D total II na přístroji cobas® 8000 – první zkušenosti
RNDr. Kateřina Andelová 1,2 , Ing. Jakub Minář 1
1) Oddělení klinické biochemie, SPADIA LAB, a.s., Ostrava
2) Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Ostrava

Firma Roche uvedla začátkem roku 2017 novou generaci metody Elecsys® Vitamin D total II v první etapě na modulu cobas e 801. Inovovaná metoda byla otestována v ostravské laboratoři společnosti SPADIA LAB, a.s. a je možné potvrdit, že došlo k dalšímu zvýšení klinické a analytické hodnoty tohoto stanovení.

Úvod

V posledních letech se enormně zvyšuje počet klinických indikací pro kvantifikaci vitaminu D v biologickém materiálu, který souvisí s narůstajícím významem tohoto analytu – vitamin D představuje důležitou komponentu v homeostáze kalcia a fosfátů v lidském organismu. Deficit vitaminu D lze pozorovat u chronických onemocnění, a to jak u chorob kostního systému (rachitis, osteoporóza, osteomalacie), tak u mimokostních nemocí (kardiovaskulární choroby, nádorová onemocnění, autoimunitní choroby, diabetes mellitus a infekce).

Syntéza a metabolismus vitaminu D

Obr. 1: Metabolismus vitaminu D a jeho regulace 

Syntéza a metabolismus vitaminu D představují složité mechanismy reakcí probíhajících v lidském organismu od neaktivních prekurzorů až k účinné formě vitaminu D (viz obr. 1). Rozlišují se dvě hlavní formy vitaminu D: vitamin D3 (cholekalciferol) živočišného původu a vitamin D2 (ergokalciferol) rostlinného původu, přičemž ergokalciferol ve stravě představuje jen omezený zdroj příjmu a majoritním zdrojem pro člověka je endogenní produkce pod vlivem ultrafialového záření 1,2. Počátečním bodem endogenní strukturální přestavby vitaminu D je tzv. provitamin D3 (7-dehydrocholesterol), resp. provitamin D2 (ergosterol), který se v epidermis účinkem ultrafialového záření konvertuje na vitamin D3 (cholekalciferol), resp. vitamin D2 (ergokalciferol). Účinnost endogenní syntézy vitaminu D je závislá na době expozice slunečnímu záření, geografické poloze, ročním období, denní době, pigmentaci kůže a použití protektivních krémů na povrchu těla. Velmi důležitým aspektem je autoregulační systém endogenní syntézy. Při déletrvající sluneční expozici nedochází k elevaci vitaminu D, ale k přeměně provitaminu na biologicky neaktivní izomery 1,2,3.  

Obě vzniklé formy vitaminu D (cholekalciferol i ergokalciferol) jsou biologicky inaktivní a pro potřeby organismu vyžadují dvoukrokovou aktivaci v játrech a ledvinách. V hepatocytech nastává primární hydroxylace v poloze 25 účinkem 25-hydroxylázy, přičemž reakcí vzniklý 25-hydroxyvitamin D (kalcidiol) je považován za nejvhodnější ukazatel stavu metabolismu vitaminu D v lidském organismu, který současně zohledňuje endogenní produkci i exogenní příjem vitaminu D potravou. Druhý stupeň dvoukrokové hydroxylace a aktivace probíhá v ledvinách v poloze 1 účinkem 25-hydroxy-1-a-hydroxylázy za vzniku 1,25-dihydroxyvitaminu D (kalcitriol). Biologicky aktivní 1,25-dihy-droxyvitamin D se intracelulárně váže na receptor vitaminu D, který je zodpovědný za biologické účinky 4.

Metoda Elecsys® Vitamin D total II

Obr. 2: Design metody Elecsys® 25(OH)vitamin D total II

V roce 2017 uvedla firma Roche k rutinnímu užívání inovovanou soupravu Elecsys® Vitamin D total II – iniciálně pro systémy e 801, nyní v dostupnosti pro systémy e 401, e 601 a e 602. Počátkem roku 2017 byl poprvé v České republice instalován nový imunochemický modul e 801 v diagnostické laboratoři SPADIA LAB, a.s., Ostrava, a to na modulárním systému cobas® 8000 v konfiguraci c 502/c 702/e 801. Součástí implementace nového modulu v rutinním režimu bylo testování inovované diagnostické soupravy Vitamin D total II. Uvažujeme-li o vitaminu D, je nutné blíže specifikovat analyt, který stanovujeme. Metoda Elecsys® Vitamin D total II kvantifikuje sumární koncentraci 25-hydroxyvitaminu D2 a 25-hydroxyvitaminu D3.

Tab. 1: Srovnání metod stanovení 25-hydroxyvitaminu D2/D3
Tab. 2: Testovaná opakovatelnost (n = 20)
Tab. 3: Testovaná mezilehlá preciznost (n = 20)
Graf. 1: Bland-Altmanův rozdílový graf, etapa I, HPLC Recipe vs. Roche Vitamin D 


Souprava se vyznačuje přímou návazností na referenční metodu Ghent LC-MS/MS s detekcí v pozitivním módu v režimu sledování vícenásobných přechodů (MRM) a návazností na certifikovaný referenční materiál NIST 2972. Dalším důležitým aspektem je blokace neaktivního metabolitu 24,25-dihydroxyvitaminu D2/D3 (pomocí specifické monoklonální protilátky), vznikajícího při dostatečné saturaci hormonálně aktivního 1,25-dihydroxyvitaminu D2/D3 v organismu. Design testu je až na přidanou blokační protilátku totožný s předchozí generací 5. Iniciačním krokem stanovení je denaturace vitaminu D vázajícího protein (VDBP) v krvi, blokace neaktivního metabolitu 24,25-dihydroxyvitaminu D2/D3 užitím specifické monoklonální protilátky a následně přídavek VDBP značeného rutheniem k reakční směsi. Tímto krokem dochází ke specifické vazbě vitaminu D z pacientských sér se značeným VDBP. K vzniklému komplexu je přidán biotinem značený vitamin D, v reakční směsi dochází ke kompetitivnímu procesu stanovovaného vitaminu D se značeným vitaminem D. Celý komplex je následně navázán na pevnou fázi magnetické mikročástice prostřednictvím vazby biotinu a streptavidinu. Detekce průběhu analytické reakce probíhá pomocí elektrochemiluminiscence (viz obr. 2). 

Inovovaná diagnostická souprava disponuje velmi uspokojivými analytickými charakteristikami testovanými v rutinní laboratoři, souhrn opakovatelnosti i mezilehlé preciznosti je uveden v tab. 2 a 3. Ke kalibraci metody byl využit inovovaný, firemně dodaný kalibrační materiál Vitamin D total II CalSet, kontrola kvality byla prováděna pomocí Vitamin D total II PreciControl (Roche) na dvou koncentračních úrovních – velmi pozitivně lze pohlížet na koncentrační úrovně použité v kontrolním materiálu s cílovými hodnotami v blízkosti klinicky významných rozhodovacích mezí. Firemní dokumentace výrobce doporučuje realizovat kalibraci metody ve frekvenci 1 x 28 dnů při používání stejné šarže reagencií, 1 x 7 dnů při používání identické soupravy v analyzátoru a/nebo dle potřeby podle vychýlení v procesu interní kontroly kvality 5. V námi testovaném období vykazovala diagnostická souprava vysokou stabilitu bez nutnosti provádění mimořádných kalibrací s absencí náhodných a systematických chyb v procesu interní kontroly kvality.

Srovnání metod

Cílem testování diagnostické soupravy bylo srovnání nové generace soupravy Vitamin D total II (Roche) s rutinně využívanou 25-OH Vitamin D total Assay (DiaSorin) na systému LIAISON® a s chromatografickým stanovením 25-hydroxyvitaminu D2/D3 použitím Recipe HPLC kitu. Základní charakteristiky měřicích technik shrnuje tab. 1. Srovnávací studie probíhala ve dvou navazujících etapách, první etapa srovnání datována na duben–červen s využitím zamrazeného biologického materiálu z Fakultní nemocnice Ostrava. Před analýzou bylo sérum temperováno na laboratorní teplotu a ve všech vzorcích byl vyšetřen 25-hydroxyvitamin D (suma 25-hydroxyvitaminu D2 a 25-hydroxyvitaminu D3) pomocí chromatografického stanovení s UV detekcí užitím 25-OH Vitaminu D2/D3 Recipe a pomocí imunoanalytických metod na systémech cobas® 8000 (Roche) a LIAISON® (DiaSorin). Do druhé etapy srovnání (květen–srpen) bylo bez bližší specifikace zařazeno celkem 349 rutinních vzorků pacientů ostravské diagnostické laboratoře SPADIA LAB, u kterých bylo lékařem indikováno stanovení 25-hydroxyvitaminu D. Aby byl minimalizován vliv preanalytické fáze ve druhé etapě, byly vzorky séra pro stanovení vitaminu D paralelně vyšetřeny na systémech cobas® 8000 a LIAISON®. Naměřená data byla statisticky zpracována pomocí softwaru MedCalc verze 16.1.2 (Belgie). Iniciálně byly hodnoceny sumární statistiky testovaného souboru I (tab. 4) a testovaného souboru II (tab. 5), ke zjištění statistické významnosti rozdílů průměrů naměřených hodnot byl použit Bland-Altmanův rozdílový graf, neparametrická regrese dle Passing-Babloka a korelační koeficient. Statistická významnost „p“ byla hodnocena dle Spearmanova testu na zvolené hladině významnosti.

Výsledky

Tab. 4: Sumární statistika výsledků srovnání, etapa I

Sumární statistiky etapy I a II testovaných metod jsou shrnuty v tab. 4 a 5. Z dat první etapy je patrný rozdíl mezi imunoanalytickými metodami a chromatografickým stanovením 25-hydroxyvitaminu D v séru. Podle očekávání je variabilita výsledků stanovení vitaminu D etapy I statisticky významná mezi chromatografickým stanovením a jednotlivými imuno-analytickými metodami (graf 1, graf 2). Kvůli ověření statistické významnosti mezi imunoanalytickými metodami navzájem bylo přistoupeno k rozšíření testovaného souboru o rutinní vzorky a porovnání obou imunoanalytických metod (Roche vs. DiaSorin). Etapa II poskytla výstupy uvedené v tab. 5, grafy 3 a 4 reflektují výstupy shrnuté v diskusní části.

Graf. 2: Bland-Altmanův rozdílový graf, etapa I, HPLC Recipe vs. DiaSorin Vitamin D
Graf 3: Passing-Bablokova regresní analýza srovnání stanovení 25-hydroxyvitaminu D, etapa II, imunoanalytické metody 
Parametry Passing-Bablokovy regresní analýzy 
Rovnice regresní přímky: Roche = 0,981.DiaSorin + 2,191 nmol/l  
Korelační koeficient r = 0,92 (p < 0,001) 
95% interval spolehlivosti směrnice (0,943–1,022) 
95% Interval spolehlivosti interceptu (-0,307–4,137) 

Diskuse

Je známou skutečností, že imunoanalytické metody stanovení 25-hydroxyvitaminu D jsou zatíženy nedostatečnou srovnatelností výsledků měření napříč výrobci diagnostických souprav 6,7. Limitujícím faktorem imunoanalytických metod jsou fyzikálně-chemické vlastnosti hydrofobního analytu 25-hydroxyvitaminu D a poměrně silná vazba na VDBP 7,8. Významnou měrou se na úrovni správnosti metod podílí úroveň vyvázání analytu z vazby na VDBP a rovněž dokonalost denaturace VDBP. Koncentrace VDBP je různá u různých skupin pacientů a tomuto také odpovídá příslušné ovlivnění naměřených koncentrací 25-hydroxyvitaminu D total II 9.  
Rovněž zkřížené reaktivity ostatních metabolitů (např. 24,25-dihydroxyvitaminu D a 3-epi-25-hydroxyvitaminu D) mohou být příčinou významných systematických diferencí, zejména u specifických klinických kohort (pacienti s poškozením renální funkce se sníženými hladinami 24,25-dihydroxyvitaminu D) nebo dětských pacientů (zvýšená koncentrace C3-epimeru do 2 let věku).

Tab. 5: Sumární statistika výsledků srovnání, etapa II, imunoanalytické metody
Graf. 4: Bland-Altmanův rozdílový graf, etapa II, imunoanalytické metody

U imunoanalytických metod velmi častá zkřížená reaktivita s 24,25(OH)2D (u diagnostické soupravy firmy DiaSorin není tato informace v příbalové dokumentaci k dispozici) byla v případě druhé generace metody Elecsys 25(OH) Vitamin D total II výrazně potlačena, nicméně příbalová dokumentace k této metodě stále deklaruje poměrně vysokou zkříženou reaktivitu vůči C-3-epimeru (113 % u 25(OH)D3 a 91 % u 25(OH)D2), která se v zásadě neliší od předchozí generace metody Elecsys. Otázkou této interference se zabýval ve své práci Van den Ouweland,11 který zjistil, že u nativních sér novorozenců (až do podílu 58 % C3-epimeru) k této zkřížené reaktivitě u metody Roche nedochází, což potvrdilo paralelní stanovení koncentrací metodou LC-MS/MS. Zjištěná zkřížená reaktivita deklarovaná v příbalovém letáku nevychází z nativních vzorků s endogenním obsahem C3-epimeru, nýbrž odráží chování u vzorků s exogenně přidaným C3-epimerem. Podobně se toto chování může projevit u vzorků využívaných v systému externího hodnocení kvality, což je potřeba brát v úvahu 11.

Naproti tomu výrazným benefitem imunoanalýzy je rychlost prováděných vyšetření a množství vzorku použitého k analýze. V komplexním pohledu je nutné konstatovat, že z námi naměřených dat nevyplývají statisticky významné rozdíly mezi metodami Vitamin D total II (Roche) a 25-OH Vitamin D total Assay (DiaSorin). Porovnání obou metod pomocí lineární Passing-Bablokovy regrese naznačuje, že obě metody poskytují srovnatelné výsledky stanovení 25-hydroxyvitaminu D (rovnice závislosti Roche = 0,981.DiaSorin + 2,191 nmol/l, přičemž 95% interval spolehlivosti směrnice obsahuje hodnotu 1 a interval spolehlivosti úseku obsahuje hodnotu 0, tedy s absencí konstantní i proporcionální chyby v celém měřeném rozsahu).

Závěr

Metoda Elecsys® Vitamin D total II (Roche) patří mezi nové, principiálně odlišné metody stanovení 25-hydroxyvitaminu D (specifická VDBP interakce), které umožňují monitorovat dostatečnou saturaci organismu vitaminem D a lze je rovněž bez obav použít u specifických klinických kohort pacientů. Přínos této inovované metody byl potvrzen testováním rutinních neselektovaných vzorků v diagnostické laboratoři. Ke zvýšení správnosti výsledku měření přispívá přímá návaznost na referenční metodu LC-MS/MS (Ghent) a certifikovaný referenční materiál NIST 2972. 

RNDr. Kateřina Andelová

RNDr. Kateřina Andelová


Ing. Jakub Minář

Ing. Jakub Minář


Literatura
  1. Kulda V. Metabolismus vitaminu D. Vnitřní lékařství 2012; 58: 400–404
  2. Racek J et al. Klinická biochemie. 2. přeprac. vyd. Praha, Galén, 2006
  3. Hlúbik P a Opltová L. Vitaminy. 1. vyd. Praha, Grada Publishing, 2004. 232 s.
  4. Tesař V, Viklický O et al. Klinická nefrologie. 2., zcela přepracované a doplněné vydání. Praha: Grada Publishing, 2015, 525 s.
  5. Elecsys Vitamin D total II. Příbalová dokumentace k diagnostické soupravě, REF 07028148190. Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim (V2, 08/2017, CZ)
  6. Ong L et al. Current 25-OH vitamin D assays: Do they pass the test? Clinica Chimica Acta 2012; 413: 1127–1134
  1. Farrell Ch et al. State-of-the-Art Vitamin D Assays: A Comparison of Automated Immunoassays with Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry Methods. Clin Chem 2012, 58 (3): 531–542
  2. Cibiček N, Vacek J et al. Principy a využití vybraných analytických metod v laboratorní medicíně. 1. vyd. Olomouc, Univerzita Palackého v Olomouci, 2014. 159 s.
  3. Heijboer AC. et al. Accuracy of 6 Routine 25-Hydroxyvitamin D Assays: Influence of Vitamin D Binding Protein Concentration. Clin Chem 2012; 58 (3): 543–548.
  4. Friedecký B a Vávrová J. Aktualizace poznatků o stavu měření 25-hydroxyvitaminu D v séru/plazmě. Minirewiew 2015–2016. Klin. Biochem. Metab. 2016; 24 (1): 10–13.
  5. van den Ouweland JMW et al. Evaluation of 3-epi-25-hydroxyvitamin D3 cross-reactivity in the Roche Elecsys Vitamin D Total protein binding assay. Clin Chem Lab Med 2014; 52 (3): 373–380.
Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.