Srdeční troponiny I a T jsou specifické a citlivé biomarkery srdečního poškození, představující preferované sérologické testy určené k hodnocení pacientů s podezřením na akutní infarkt myokardu. Pro klinické použití jsou v současné době aktuálně po celém světě k dispozici troponinové testy různé úrovně citlivosti. Řadu let se také používají tzv. „vysoce citlivé“ testy. Harmonizace těchto testů je žádoucím cílem, zůstává však úkolem k řešení v nejbližší (?) budoucnosti.

Něco málo z fyziologie troponinů

Troponin, který je nedílnou součástí kontraktilního aparátu, se nachází v drážce mezi aktinovými filamenty v každé svalové tkáni (kosterní svaly, srdeční sval) a  představuje komplex tří regulačních proteinů připojených k  jinému proteinu zvanému tropomyosin.

Existují tři formy troponinu (C, I, T), z nichž jako markery srdečního poškození (kardiomarkery) slouží pouze troponin I (cTnI) a T (cTnT), neboť oba mají jedinečné, pro myokard specifické aminokyselinové složení. Normálně se v krvi cTnI ani cTnT nevyskytují. Jsou pevně vázány v kardiomyocytech (buňkách srdeční svaloviny) a malá část tvoří jejich cytosolovou frakci (v  obou případech tento podíl činí cca ≤ 8 %). Při poškození kardiomyocytů dochází vlivem změny permeability jejich buněčné membrány k  vyplavování cTnI a  cTnT do  krevního řečiště. Vzestup jejich hladin v krvi je vyvolán především rychlým uvolněním právě cytoplazmatické frakce. A tento fakt je základem využití cTnI a cTnT jako kardiomarkerů.

Metody měření cTnI a cTnT s přívlastkem vysoce citlivé, tzv. hs (high sensitivity), musí v současnosti splňovat mnohá analytická kritéria uvedená v aktuálním doporučení expertů IFCC.1 Za základní požadavek na celkovou preciznost měření se považuje hodnota vyjádřená jako CV†   ≤ 10  % pro koncentrace o  hodnotě 99. percentilu¥ fyziologických hodnot a  vyšší. Současně metoda „hs“ musí být schopna stanovit číselně vyjádřené koncentrace u nejméně 50 % dospělých mužů a žen z  referenčního souboru zdravých osob nad hodnotou LoD (Limit of Detection).

Z klinického hlediska musí „hs“ metody na stanovení troponinů mít minimálně: 1. zvýšenou citlivost pro časnější detekci (zkrácení diagnostického intervalu) zvýšených hodnot nad 99. percentilem fyziologických hodnot; 2. sníženou specifičnost k vyloučení ostatních příčin možného vzestupu troponinů a umožnění stratifikace rizika pacientů s akutním koronárním syndromem v diferenciální diagnostice ischemických/neischemických příhod.

Metrologické aspekty stanovení troponinů

Metrologická ⁵ návaznost kalibrátorů laboratorních metod na referenční metody a/nebo dostupný certifikovaný referenční materiál (CRM) je univerzálním nástrojem standardizace zacílené na globální srovnatelnost laboratorních výsledků, což platí nejen pro odbornost klinické biochemie (801). Pouze standardizace metod může zajistit klinikům faktickou srovnatelnost výsledků laboratorních metod napříč různými analytickými systémy.

Harmonizací vyšetření se v jistém smyslu rozumí nižší úroveň standardizace a ilustruje stav, kdy v  době neexistence mezinárodního standardu, na nějž by se mohly metody všech výrobců navázat, se blíže neurčeným technicky vhodným postupem (modelováním, resp. počítačovou simulací nastavení hodnot kalibrátoru) zajistí potřebná úroveň klinické srovnatelnosti výsledků měřených veličin.

Aby byly metody standardizované či alespoň harmonizované, musí právě výrobci zajistit, že jejich analytické systémy/metody mají návaznost na vhodné certifikované referenční materiály nebo postupy měření a že nejistota kalibrátorů je dokumentována. Analyty se pak t. č. podle možnosti své standardizace/ harmonizace dělí na: typ A (dobře definované chemické entity, tzv. navázatelné na SI jednotky) nebo typ B (heterogenní analyty přítomné v humánních vzorcích, které však nelze na SI jednotky přímo navázat). Zatímco analytický typ A reprezentuje malý počet (cca 65) dobře definovaných sloučenin náležejících do klasické chemie (např. elektrolyty, minerály, cholesterol, kreatinin, steroidní hormony a vitaminy), typ B představují všechny ostatní analyty obvykle měřené imunochemickými metodami, včetně proteinů, troponiny nevyjímaje. Často jde o limitně „esoterické“ sloučeniny, které lze snadno odhalit podle toho, že jejich výsledky se vyjadřují například pomocí arbitrárních jednotek (př. WHO IU) nebo také hmotnostních jednotek (viz troponiny). „Esoterické“, B typy analytů, měřené imunochemickými metodami jsou tedy největší současnou výzvou ke standardizaci/harmonizaci, neboť výrobci těchto metod mají různé vlastní „pultovní“ kalibrátory a mezinárodně uznávané referenční materiály/postupy měření často nejsou k dispozici.

V tomto ohledu je namístě poznámka, že právě každý jednotlivý výrobce metody na stanovení cTnI má svůj vlastní kalibrátor (patentované protilátky proti konkrétnímu epitopu₡ na molekule měřené veličiny – TnI), přičemž žádný z těchto „pultovních“ kalibrátorů není dosud navázán na mezinárodní standard cTnI, a to navzdory faktu, že tento standard fakticky existuje (NIST SRM 2921), což se dá přirovnat ke stavu, jako kdyby každý výrobce cTnI – z  těžko klinikovi pochopitelných důvodů – měřil jiným metrem. Faktickým důsledkem takového počínání je, že i v renomovaných klinických studiích zacílených na vzájemné porovnání hs metod cTnI se často uvádějí výsledky naměřené v různých specifických zařízeních, založené na analýzách, v nichž se používají různé protilátky rozlišující různé antigeny/epitopy, byť stejného analytu, nebo se v dvoukrokových imunoanalýzách volí různé záchytné/detekční protilátky. Takové analytické srovnávání se pak nejen z metrologického úhlu pohledu nutně musí zcela míjet se zamýšleným účelem klinického použití, ale především s finálním cílem globální srovnatelnosti.

V současnosti i zpětně historicky se za nejhůře metodicky srovnatelný analyt považuje právě cTnI. Je totiž po dlouhá léta známo, že se výsledky TnI napříč jednotlivými analytickými systémy mohou významně lišit. Ještě donedávna se uvádělo, že mnohdy až 300x. Proto i výrobci v příbalových letácích v lepším případě důrazně odkazují na vlastní klinické rozhodovací meze cTnI. Ty se však také výrobce od výrobce navzájem významně liší! Výrobci to následně řeší tím, že uživatele v příbalových letácích opět důrazně vybízejí k ověřování těchto mezí, aniž by je to zbavovalo implicitní povinnosti provádět jejich řádnou klinickou validaci před vlastním uvedením metody na trh. Řádně otestované a  výrobci klinicky validované jsou dle autorů B. Friedeckého a  J.  Kratochvíly2 dosud pouze dvě soupravy na stanovení hs troponinů, a to hs cTnI výrobce Abbott a  hs cTnT výrobce Roche, přičemž hs cTnT jako metoda monopolního výrobce má i  řádně klinicky validovanou hodnotu cut-off, tedy i výhodu faktické globální klinické srovnatelnosti výsledků v rámci pracovišť, která tuto metodu používají.

Klinické poznámky k použití metody hs cTnT v porovnání s metodami hs cTnI

Výhodou laboratorní metody stanovení hs cTnT oproti metodám hs cTnI je v první řadě její delší čas vývoje a srovnatelně delší doba klinického ověření, na němž se podílela celá řada významných osobností z oboru klinické biochemie i v ČR. Byl to především prof. MUDr. M. Engliš, DrSc., jenž po  dlouhá léta vedl diskusi na  toto téma, která na  konci více než desetiletého vývoje vyústila mj. právě ve  vysokou citlivost metody a  potvrzení její nezpochybnitelné negativní prediktivní hodnoty (tj. že hodnoty nacházející se pod hodnotou cut-off, tedy negativní, potvrzují neexistenci myokardiální ischemie), což bohužel dosud nelze tvrdit na  100 % o některých metodách na stanovení cTnI. Metoda hs cTnT je totiž v současné době jedinou metodou se standardizovanými rozhodovacími hodnotami, což má nesporný klinický a praktický význam, zatímco vysoce různé „hs“ citlivosti metod na  stanovení cTnI za  jistých klinických okolností mohou velmi limitovat jejich praktickou využitelnost v  diferenciální diagnostice akutních srdečních příhod.

Téma mírně zvýšených hodnot hs cTnT u  hemodialyzovaných pacientů bylo v  minulosti velmi zevrubně diskutováno a  na  světlo světa se dostaly závěry řady studií, které potvrdily využití  právě hs cTnT jako nezávislého prediktoru horší transplantační prognózy u těchto pacientů, vypovídajícího navíc o  multifaktoriálním či blíže nespecifi kovaném poškození myokardu, resp. o  poškození srdeční svaloviny ischemií související s  hyperkatabolickým stavem při ledvinovém selhávání. Četné studie ^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}  tím vyvrátily původní diskusní otázku údajné falešné pozitivity hs cTnT u těchto pacientů.

Dlouhodobý vývoj metody stanovení hs cTnT v podstatě zajistil rychlý nástup využití tzv. delta hodnot (Δ), což jsou minimální změny (tedy nárůsty nebo poklesy) měřené veličiny zjištěné při opakovaných měřeních v doporučených intervalech (tj. obvykle za 1–3 hodiny, u hs cTnT už za 1 hodinu). Ty významně zpřesňují využití získaných hodnot následných měření hs cTnT jako cíleného ukazatele stratifikace rizika pacientů s akutním koronárním syndromem v diferenciální diagnostice ischemických/neischemických příhod. Váhající klinik může s jejich pomocí docílit téměř 100% jistoty, s níž lze akutní infarkt myokardu (AIM) buď potvrdit, nebo vyloučit, viz obrázek č. 1.

Delta hodnoty pro metody hs cTnI jsou již také k dispozici. Nicméně na rozdíl od  hs cTnT mají jednotlivé metody určené ke  stanovení hs cTnI samozřejmě různé rozlišovací delta hodnoty, jakož i  doporučené intervaly měření podle jednotlivých klinických studií, což může klinikům činit nemalé diagnostické problémy. Úkolem laboratoří, které provádějí „hs“ měření troponinů, však není respektovat časté přání kliniků na „jednotné referenční meze, resp. hodnoty cut-off “. V případě troponinů to za stávajícího stavu techniky a neexistence harmonizace hs cTnI metod ani není možné. Za všech technických a  personálních podmínek by cílem snažení laboratorních týmů mělo být: poskytovat exaktní výsledky všemi dostupnými metodami, nejen těmi určenými ke  stanovení troponinů! Moudří klinikové posuzují výsledky metod vždy minimálně srovnáním s konkrétními rozhodovacími mezemi poskytovanými a ověřenými danou laboratoří a v případě jakýchkoliv dilemat či pochybností v diferenciálně diagnostickém procesu by na úrovni laboratoře měly být k dispozici adekvátní konzultační služby.

Kardiologové často argumentují, že řada pacientů s chronickými formami ICHS má „svou“ konkrétní chronickou hodnotu troponinu hs cTnT. I takové hodnoty se však v rámci studií ^18,19  osvědčily jako další, v praxi dobře použitelný nezávislý ukazatel horší prognózy ICHS onemocnění, a tak se s pomocí výše uvedených delta hodnot klinikové mohou rozhodnout, zda i v těchto případech výsledek měření hs cTnT diagnózu AIM potvrzuje, či nikoliv.

Nespornou výhodu stanovení hs cTnT oproti cTnI představuje pro ambulantní specialisty v terénu jeho jednoznačně vysoká stabilita v biologickém materiálu, tj. neexistence významné závislosti kvality vyšetření na  přesném dodržení preanalytických podmínek odběru a na rychlém transportu, na rozdíl od  troponinů I. Dominantní formu cTnT v krvi totiž představuje jeho volná forma, pouze v malé míře je cTnT vázán v terciálním komplexu cTnC-cTnI-cTnT. Uvolněný cTnT je v krvi přítomen v uniformní a stabilní formě a vysvětlení výborné stability cTnT v krvi je proto snadné: volný cTnT je hydrofilní a relativně rezistentní protein. Molekula cTnT tím, že neobsahuje cysteinová rezidua, nepodléhá oxidoredukčním vlivům. Epitopy, vůči kterým jsou zaměřeny protilátky v analytické soupravě ke stanovení hsTnT Roche Diagnostics, proto nemohou být fosforylovány.

Naproti tomu je volný cTnI čistě hydrofobní, a tím i méně stabilní protein s tendencí vázat se na jiné proteiny (především na  cTnC a  cTnT). Koncentrace volného cTnI je v krvi velmi nízká nebo neprokazatelná. Hlavní formy cTnI představují binární (cTnI-cTnC) a terciální (cTnC-cTnI-cTnT) komplexy. Volný i v komplexech vázaný cTnI může být až z 50 % na několika místech fosforylován a na dvou cysteinových reziduích oxidován nebo redukován.

Jako důkaz klinické spolehlivosti metody hs TnT může být uveden fakt, že v historii laboratoře OKB-H Nemocnice Prachatice, a.s., nebyl zaznamenán žádný případ, kdy by nebyl laboratorně zjištěn čerstvý záchyt AIM potvrzený následně dalšími vyšetřovacími metodami. Na rozdíl od metody na stanovení hs TnI, kterou používají smluvní laboratoře ve stejném kraji. Je proto důležité si uvědomit, že se vyplácí mít vlastní letitou klinickou zkušenost s konkrétní metodou stanovení troponinu – a naše laboratoř úspěšně poskytuje svým zákazníkům stanovení hs cTnT již 10 let jako řádně akreditovanou metodu.

Závěr

Držme se staré dobré kvality! Toť motto závěrečného autorského slova s tím, že pro laboratorní provozy tzv. okresního dosahu s  poměrně velkým zázemím ambulantních lékařů, kteří posílají své požadavky na stanovení troponinu z větší či menší vzdálenosti od dané zdravotnické laboratoře, je důležité, aby analyt nebyl transportem ovlivněn. Čili pro podobná laboratorní pracoviště a jejich zákazníky je klíčová především stabilita měřeného analytu a řádně klinicky ověřená spolehlivost metody. Proto za mnohem výhodnější považují autoři tohoto sdělení měření hladin hs cTnT oproti hs cTnI. Někteří kardiologové z kardiocenter požadují stanovení hs cTnI. Často s nepsaným komentářem, že hs cTnI preferují jako formu troponinu s  větší diagnostickou výpovědní hodnotou, ovšem bez řádného uvedení pádných argumentů a  náležitých faktických důkazů. Domnívají se, že výhodou méně senzitivního stanovení hs cTnI je to, že se nezvyšuje u tolika pacientů s nekoronárním postižením myokardu. ²⁹ Je to, jako by chtěli jezdit v trabantu, když mají v garáži mercedes či BMW. Tito kliničtí specialisté se patrně v laboratorní metrologii vůbec neorientují, požadavky současné laboratorní kvalimetrie na jednotlivé imunochemické metody nechápou (a to nejen pro stanovení troponinů) a  z  důvodu neznalosti je nepovažují za hodné respektu.