article main title
Porovnání metod Elecsys PTH a Elecsys PTH (1-84) na vzorcích z rutinní klinické praxe
Ing. Petr Vaník 1
1) Oddělení laboratorní medicíny, ONN a.s. Nemocnice Rychnov nad Kněžnou

PTH je klíčový hormon pro udržování kalciové homeostázy. Patří mezi endogenní regulátory kalcium-fosfátového metabolismu, hraje významnou roli v regulaci kostních minerálů - vápníku, fosforu a hořčíku. U zdravých osob dochází již při malém poklesu koncentrace ionizovaného vápníku k sekreci PTH. Parathormon reguluje hladinu vápníku působením na metabolismus kostí stimulací procesu kostní remodelace. Při fyziologické sekreci PTH je udržována rovnováha mezi odbouráváním a novotvorbou kostí, při dlouhodobě zvýšené sekreci parathormonu začíná převládat katabolický účinek a tím dochází k destrukci kostní hmoty. Zvýšená hladina parathormonu stimuluje zpětnou resorpci vápníku v distálním tubulu a tlusté části vzestupného raménka Henleovy kličky ledvin. Zároveň také zvyšuje vylučování fosfátů snížením zpětné resorpce v proximálním tubulu. PTH v ledvině také stimuluje činnost enzymu 1-α-hydroxylázy, která zvyšuje přeměnu 25-hydroxycholekalciferolu (kalcidiolu) na 1,25-dihydroxycholekalciferol (kalcitriol), a tím nepřímo ovlivňuje vstřebávání vápníku, fosforu a hořčíku v trávicím traktu.  

Obr. 1: Molekula PTH 1-84 s vyznačeným místem štěpení 

Ribozomy buněk příštítných tělísek syntetizují Pre-pro-PTH o délce 115 aminokyselin. V endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu je zkrácen na pro-PTH o délce 90 aminokyselin a následně o dalších 6 aminokyselin na molekulu PTH. Syntetizovaný PTH je skladován v sekrečních granulích v cytoplazmě, odkud může být v případě potřeby okamžitě uvolňován. Vznik mRNA pro zahájení ribozomální syntézy PTH zvyšuje nejen hypokalcemie, ale také snížení hladiny fosfátu nebo vitaminu D. Intaktní molekula PTH je tvořena řetězcem 84 aminokyselin s celkovou molekulovou hmotností přibližně 9,43 kDa. Po uvolnění z denzních granulí dochází velmi rychle (v minutách) k proteolýze a jsou vytvářeny cirkulující fragmenty. Degradace začíná již v příštítných tělískách a pokračuje především v játrech a ledvinách. Vzniklé fragmenty jsou z krevního řečiště odstraňovány mimo jiné glomerulární filtrací. Nejčastěji dochází ke štěpení mezi 34. a 35. aminokyselinou, kdy vzniká biologicky aktivní N-fragment, vázající se na PTH receptory, s biologickým poločasem okolo 2 minut, a C-terminální fragment, který je vylučován glomelurální filtrací (obr. 1). Jeho biologický poločas v plazmě se u zdravých osob pohybuje mezi 30-40 minutami, u pacientů s renálním selháváním se může výrazně prodlužovat. V krvi zdravých osob je 5-25 % intaktního PTH, 75-95 % C-terminálního fragmentu a pouze zlomek N-terminálního fragmentu. Během metabolismu PTH vzniká také část non 1-84 fragmentů, které mají neúplnou N-terminální část molekuly. Jedná se především o fragment 7-84 a dále pak fragmenty 5-84, 8-84, 10-84 nebo 15-84. U zdravých osob je množství těchto neúplných fragmentů celkem zanedbatelné, ale u pacientů s onemocněním ledvin může být v oběhu i několik desítek procent různých non 1-84 fragmentů. Samostatnou kapitolu tvoří molekula amino-PTH, která má modifikované aminokyseliny v oblasti 15-20. Zvýšená tvorba amino-PTH se může vyskytovat u nádorů příštítných tělísek. 

Obr. 2: Změny vybraných parametrů v průběhu hemodialýzy 

Laboratorní stanovení PTH je využíváno při sledování pacientů s poruchami kalciového nebo kostního metabolismu, dále u pacientů při operacích příštítných tělísek (primární hyperparathyroidismus) a také u pacientů s chronickým renálním onemocněním (sekundární hyperparathyroidismus), kteří vyžadují pravidelné sledování koncentrace PTH. Základním terapeutickým postupem u pacientů se selháním ledvin je pravidelná dialyzační léčba. Pro dosažení co nejlepších výsledků je snaha o „optimalizaci“ dialýzy, jejímž cílem je provedení co nejúčinnějšího odstranění katabolitů a vody, a zároveň bezpečného procesu z hlediska eliminace komplikací v průběhu hemodialýzy. Mezi parametry, které mohou ovlivnit účinnost dialyzačního procesu patří nejen volba dialyzátoru a dialyzačního roztoku, ale také rychlost průtoku krve nebo délka dialýzy. Clearence endogenního kreatininu zdravých ledvin je okolo 1 200 litrů za týden, při léčení hemodialýzou 3x týdně je clearence kreatininu asi 150 litrů. Pro odstranění přebytečné vody z organismu je limitující délka dialýzy, aby nedošlo k náhlému poklesu intravaskulárního objemu.

Obr. 3: Vazebná místa pro protilátky kompletní molekuly PTH 1-84 a non 1-84 fragmentů 5-84, 7-84 a 15-84. Zeleně - vazebná místa pro PTH intaktní; modře - vazebná místa pro PTH (1-84); červeně - místo štěpení v pozici 34-35

Při nastavení všech parametrů dialyzačního procesu na co možná nejoptimálnější hodnoty dokáže hemodialýza velmi úspěšně eliminovat vodu a nízkomolekulární katabolity, ale zároveň s tím také dochází v průběhu několika desítek hodin k výrazným změnám koncentrace vápníku a fosfátů, a to opakovaně (obr. 2). Úskalím při hemodialýze je odstranění látek s vyšší molekulovou hmotností nebo i nízkomolekulárních látek vázaných na proteiny. Základní dialyzační technika nedokáže téměř vůbec eliminovat látky s molekulovou hmotností nad 12 kD a vyšší. Proto jsou u pacientů sledovány látky, které jsou touto technikou obtížně odstraňovány. Jedná se buď o retinované netoxické látky nebo o uremické toxiny, které jsou přímo zodpovědné za určitý biologicky negativní účinek. Ke specifickým uremickým toxinům patří například β-2-mikroglobulin, některé proteiny imunologických reakcí, homocystein a v neposlední řadě také parathormon. 

Tab. 1: Základní charakteristiky metod pro stanovení parathormonu
Obr. 4: Výsledky EHK SEKK, cyklus BM 1/14 

Metody pro laboratorní stanovení hladiny PTH můžeme rozdělit do 3 generací podle toho, jakou část molekuly jsou schopny detekovat. I. generace, používaná především v prvních RIA metodách, nebyla zcela specifická pro celou molekulu PTH. Docházelo ke zkříženým reakcím s biologicky neúčinným C-fragmentem, chyběla standardizace metody. Tyto průkopnické metody byly využívány spíše jako doplňkové testy při vyšetřování funkce příštítných tělísek. Metody II. generace byly vyvinuty se snahou o změření celé molekuly - intaktního PTH. Vazebná místa pro protilátky byla orientována i na biologicky aktivní část molekuly. Problémem však zůstávají non 1-84 fragmenty, které mohou vést k falešně vyšším výsledkům u některých skupin pacientů. K eliminaci falešných reakcí non 1-84 fragmentů jsou vyvíjeny metody III. generace. U těchto metod je snaha o posunutí vazebného místa protilátky co nejvíce k N-terminálnímu konci molekuly PTH, což by mělo vést ke stanovení celé molekuly PTH, tzv. biointaktního PTH (obr. 3). Metoda Roche Cobas PTH intaktní se řadí mezi metody II. generace, která stanovuje molekulu PTH ještě před rozštěpením mezi aminokyselinami v pozicích 34 a 35. Protilátka značená rutheniovým komplexem se váže na C-terminální část molekuly v pozici 37-42, biotinylovaná protilátka reaguje s N-koncem v pozici 26-32. Typickým zástupcem metod III. generace je souprava Roche Cobas PTH (1-84). Na C-konec molekuly se v pozicích 54-59 váže protilátka značená rutheniovým komplexem, druhá protilátka s navázaným biotinem je senzitivní k pozicím 1-5 N-konce molekuly parathormonu. Základní charakteristiky obou metod jsou uvedeny v tabulce 1. 

Obr. 5: Výsledky EHK RIQAS, vzorek 4/14

Od letošního roku došlo v systému EHK SEKK u kontrolního vzorku pro kostní markery k rozlišení používaných metod mezi PTH intaktní a PTH (1-84). Po-dle uvedených údajů pro cyklus BM1/14 používá 23 českých a slovenských laboratoří stanovení PTH (1-84), což je při celkovém počtu 111 účastníků téměř 21 % (obr. 4). V mezinárodním kontrolním systému RIQAS uvedlo metodu měření některým ze systémů III. generace 48 účastníků, což je 7,5 % ze všech 648 laboratoří (obr. 5). V naší práci jsme změřili hladinu parathormonu u 85 pacientů, převážně s chronickým poškozením ledvin. Převažující diagnóza u pacientů byla N289 (onemocnění ledvin a močovodu NS), 42 vzorků bylo od pacientů z nefrologické ambulance a 43 vzorků z dialyzačního střediska. Pro měření jsme použili soupravu Roche Cobas PTH intaktní (II. generace) a Roche Cobas PTH (1-84) - „biointaktní PTH“ (III. generace). Vyšetření bylo provedeno zároveň z jednoho odběru na imunonalytickém systému Cobas e 601. Výsledky měření jsou zhodnoceny pomocí programu MedCalc a uvedeny v přiložených tabulkách a grafech. 

Z našich výsledků vyplývá, že hodnoty naměřené metodou Roche PTH (1-84) u pacientů s chronickým renálním onemocněním jsou v průměru o 40 % nižší než hodnoty získané metodou Roche PTH intaktní. Odchylka měření vzrůstá s hladinou PTH, u vysokých koncentrací parathormonu jsme metodou PTH intaktní naměřili i dvojnásobné hodnoty ve srovnání s PTH (1-84). Pokud jsou u zdravých jedinců uváděny obdobné očekávané hodnoty: PTH (1-84) : (1,58-6,03 pmol/l) a PTH intaktní: (1,6-6,9 pmol/l), je velmi důležité u zvýšených hodnot získaných metodou PTH intaktní zvažovat možnost ovlivnění získaných výsledků renálním selháváním. Pokud laboratoř vyšetřuje PTH především u dialyzovaných pacientů, měla by posoudit možnost měřit PTH některou z metod třetí generace, u kterých nedochází k ovlivnění stanovení nespecifickými reakcemi a dokážou měřit koncentraci kompletní molekuly biointaktního PTH. Také na výsledkových listech bychom měli uvádět, zda se jedná o hodnotu získanou metodou PTH intaktní nebo PTH 1-84. 

Graf 1,2 (vlevo): Statistické zhodnocení všech vzorků
Graf 3,4 (uprostřed): Statistické zhodnocení skupiny dialyzovaných pacientů 
Graf 5,6 (vpravo): Statistické zhodnocení skupiny pacientů z nefrologické ambulance
Ing. Petr Vaník

Ing. Petr Vaník


Literatura
  1. Broulík P., Dvojí účinek parathormonu na kostní tkáň, Interní med.10(5), 2008
  2. Cobas Roche PTH (1-84) – originální návod diagnostické soupravy, Roche, 2014
  3. Cobas Roche PTH intaktní – originální návod diagnostické soupravy, Roche, 2013
  4. Ďurovcová E. a kol., Stanovenie parathormónu u pacientov s chronickou obličkovou chorobou, Labor Aktuell 03/12
  5. D´Amour P., Brosaard J.H., Rousseau L., et al.: Amino-terminal form of parathyroid hormone (PTH) with immunologic similarities to hPTH (1-84) is overproduced in primary and secondary hyperparathyreoidism. Clin. Chem 2003; 49
  6. Kreze A., Praktická endokrinológia, SAP, 1993
  1. Racek, J. a kol., Klinická biochemie, Galén, 1999
  2. RIQAS Randox Laboratories, www.riqas.com
  3. SEKK s.r.o. Pardubice, www.SEKK.cz
  4. Silbernagl S. - Despopoulos A., Atlas fyziologie člověka, Avicenum, 1981
  5. Sluková S., Možnosti a limity dialýzy, Postgraduální medicína, PM 1/2006
Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.