article main title
Polymerázová řetězová reakce v průběhu třiceti let od první publikace – 5. část
MUDr. Emil Pavlík, CSc. 1
1) Ústav imunologie a mikrobiologie, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze, Studničkova 7, Praha 2. Odborný asistent katedry zdravotnických oborů a ochrany obyvatelstva Fakulty biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze se sídlem Sportovců 2311, Kladno. Vedoucí lékař Sérologické laboratoře Ústavu lék. biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN Praha.

V polovině poslední dekády 20. století již není ve vyspělém světě diagnostická laboratoř, které by nebyl nabídnut nějaký systém molekulárně biologické detekce infekčních agens. Navíc se řada laboratoří pokoušela vyvíjet vlastní testy, u nichž při standardizaci čelila množství obtížně řešitelných problémů, přesto však některé byly úspěšné. Nevím, jak by se tito protagonisté dívali dnes s odstupem dvaceti let na svoji tehdejší činnost, nicméně vnitřní uspokojení z dobře vykonané práce tehdy určitě nechybělo. Pro takto vzniklé metody se postupně vžilo označení „home-brewed“ (česky samovar).

Ani Česká republika nebyla výjimkou. Pár příkladů za všechny: dr. Žďárský a dr. Půtová na 3. LF UK v Praze, kolektivy dr. Plíškové a dr. Plíška v Hradci Králové, dr. Šerého v Brně i na některých dalších pracovištích v republice dosáhli pozoruhodných výsledků. Pokud se tak stalo v akademické sféře, nic se nedělo, neboť pro výzkumné využití neplatila patentová ochrana. Na tu však narazily pokusy o využití výsledků výzkumu v rutinní diagnostické praxi – tedy u vyšetření hrazených ze zdravotního pojištění nebo pacientem samotným. I přes pocit vlastní vysoké důležitosti, kterému my Češi občas propadáme, rozsah porušování patentových práv ve vztahu k podílu desetimilionového Česka na celkovém obchodu s PCR byl vcelku zanedbatelný a nepředstavoval problém. Ten hrozil ve velkých zemích.

Jako nejčastější výhodu tzv. samovarů zmiňovali autoři především nízkou cenu jednoho vyšetření. K jejímu dosažení však většinou pomáhaly specifické podmínky jednotlivých pracovišť. Ve FN Hradec Králové to byla investice spojená s výstavbou nového pavilonu na přelomu osmdesátých a devadesátých let, která zahrnovala i přístrojové vybavení laboratoří kryté státním rozpočtem. O tři roky později dokončované pavilony Masarykovy nemocnice na Severní Terase v Ústí nad Labem již tak velkou výhodu nepřinesly, neboť zde se již projevila inflace i výrazný pokles směnného kurzu koruny. Pokud laboratoř nemusela započítávat amortizaci přístrojového vybavení, dosáhla samozřejmě výrazných úspor v nákladech.

První, kdo se k problému samovarů postavil čelem, byla DGHM (Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie), jejíž experti připravili předpis Mio 1, upravující podmínky standardizace molekulárně biologických testů používaných pro diagnostiku infekčních agens. V předpise jsou podrobně popsána možná rizika jednotlivých molekulárně biologických testů a pro laboratorně připravené, průmyslově nevyráběné testy je určena povinnost provádět v každém běhu celou řadu paralelních kontrol, za něž u komerčních testů odpovídá výrobce. Tím se samozřejmě cena samovaru rázem dostala do jiných dimenzí. Jak se ukázalo, předpis vadil i některým výrobcům z EU (zejména z Itálie a Španělska), kteří o několik let později úspěšně lobbovali proti jeho převzetí do legislativy EU.

Konkurenti Roche

PCR společnosti F. Hoffmann-La Roche AG konkurenty měla. Vesměs se jednalo o výrobky firem, které odmítly myšlenku na nákup licence a rozvíjely alternativní techniky, které následně přihlašovaly k vlastní patentové ochraně. Společnost Abbott Laboratories Inc. tak vyvinula ligázovou řetězovou reakci (Ligase Chain Reaction – LCR), na jejímž principu uvedla na trh testy pro detekci chlamydií a gonokoků, čímž se spolupodílela na postupném vytlačování neamplifikačních hybridizačních testů firmy GenProbe Inc., distribuovaných rakouskou společností Epignost GmbH z evropského trhu. Ta odpověděla distribucí testu firmy Digene Inc. určeného k hybridizační detekci lidských papilomavirů, podílejících se na vzniku karcinomu děložního hrdla, což v podmínkách ČR znamenalo zavedení screeningového vyšetřování žen.

V oblasti virové hepatitidy C se v Brně a Hradci Králové objevila technologie branch DNA firmy Chiron, využívající amplifikaci signálu. GenProbe Inc. záhy odpověděla tím, že na trh uvedla soupravu PACE 2 pro detekci chlamydií a gonokoků po amplifikaci ribozomální RNA technikou TMA (Transcription Mediated Amplification).

Následně, na stejném principu, avšak již s jiným evropským distributorem, jímž byla firma Bio-Mérieux, přichází test MTD, zaměřený na Mycobacterium tuberculosis a systém hybridizačních sond Accuprobe pro druhové určení mykobakterií MAI a MOTT z  předkultivovaného nebo amplifikovaného materiálu v systému 16S RNA. Jelikož Amplicor MTB test amplifikoval 585 bp dlouhou DNA sekvenci genu kódujícího 16S RNA, byly s ním sondy Accuprobe kompatibilní a bylo je možné využívat k dourčení MOTT (Mycobacterium other than Tuberculosis).

Další alternativní metodou byla NASBA (Nucleic Sequence Based Amplification) firmy Organon Teknika, odvozená z 3SR (Self Sustained Sequence Replication), což byla historicky první laboratorní technika pro amplifikaci RNA, popsaná v roce 1989. Podobně jako TMA je založena na amplifikaci rRNA. V České republice se sice neujala, nicméně její podíl na prodeji molekulárně biologických testů k detekci HIV a hepatitidy C v Evropě zanedbatelný nebyl. Výčet konkurenčních metod by nebyl kompletní bez SDA (Strain Displacement Amplification) firmy Becton and Dickinson. I přes pravidelné prezentace na výstavách pořádaných v rámci kongresů po celém světě (Vídeň, Singapur, Boston, Buenos Aires, Atlanta, Glasgow) neopustila tato technika po celou dekádu laboratoře státu Utah a rozšířila se až s objevem PNA sond po roce 2000. 

Při vzpomínce na český a slovenský trh té doby nelze opomenout řadu dalších dodavatelů zastupujících různé výrobce některých komponent pro PCR a molekulárně biologické technologie jako s.r.o. Dynex, Elisabeth Pharmacon, GeneTica, Biomedica, Laboserv, ASCO, DAKO a další, jejichž pracovníci obdivuhodně doplňovali trh všude tam, kde měl rezervy. Šlo například o izolační soupravy Mo-Bio pro izolaci nukleových kyselin z rozličných materiálů včetně půdy, fekálií a odpadních vod, mikropórové filtrační izolační kolonky Qiagen, alternativní typy amplifikačních cyklérů (SmartGene, Indycycler aj.).

V roce 1995 přichází na trh test Amplicor EV. Jedná se o rodově specifický test na enteroviry, jehož pomocí lze prokazovat společnou sekvenci poliovirů 1–3, enterovirů 68–71, echovirů 1–9, 11–21, 24–27, 29 a 30–33 a coxsackievirů A3, A5, A6, A7, A9–A22, A24 a B1–6 v mozkomíšním moku. Připravuje se test Amplicor CMV z krevní plazmy. Tento test přichází na trh počátkem roku 1998.

Kurzy PCR na ÚIM 1. LF UK

Strategické změny v Roche

V roce 1996 se konalo ve Švýcarské konfederaci referendum o vstupu do Evropské unie. Necelého čtvrt procenta obyvatel vychýlilo výsledek na nevstupovat. Upřímně řečeno, lze Švýcary pochopit. Vzhledem k úrovni ekonomického rozvoje země by v rámci EU patřili k čistým plátcům, takže nynější stav, kdy dalším referendem v roce 2004 přistoupili k schengenskému prostoru a s EU mají uzavřenu soustavu smluv o  vzájemně výhodné spolupráci, vyhovuje lépe. Tehdy, bezprostředně po referendu, však velké švýcarské společnosti ovládl strach z možných celních bariér při vstupu na trh EU. A začaly konat: hledalo se sídlo společnosti v EU s možností výroby.

V květnu 1997 hostili Švýcaři v Lausanne 8. kongres European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, doprovázený velkou výstavou. Na  těchto akcích bývá o  přestávkách mezi jednáními jednotlivých odborných sekcí většinou jako v  úle. Když jsem 27. května dopoledne vešel do výstavní haly, překvapilo mne nezvyklé ticho. Firemní zástupci na stáncích byli poněkud zaražení. Došel jsem do stánku Roche. Dr. Hans-Joachim Burkhardt mne vyzval, abych se posadil. Po chvilce otálení jsem si konečně sedl a následně pochopil, proč. Před 10 minutami oficiálně oznámili, že fa Roche koupila společnost Boehringer Mannheim! Jak se později ukázalo, informace nebyla přesná. Ve  skutečnosti finanční divize Roche koupila finanční společnost vlastnící Boehringer Mannheim a belgického výrobce ortopedických pomůcek DePuy Synthes. O snaze Roche získat Boehringer neměl nikdo tušení. Jak už to v životě bývá, překvapení vystřídal vztek a napadení transakce u orgánů EU i Spolkové republiky Německa. Po téměř rok trvajícím projednávání byla transakce odsouhlasena a akvizice mohla začít.

Areály Boehringeru měly ve většině zemí vyšší hodnotu než obdobná zařízení Roche. A tak se stěhuje Roche Molecular Systems v Kalifornii z Alamedy za hory do Pleasantonu, centrální evropské sklady Roche ze Štrasburku do Mannheimu, část vývojových provozů do Penzbergu u Mnichova apod. Prodejem firmy DePuy Synthes koncernu Johnson & Johnson o rok později byla završena tato ekonomicky velmi úspěšná akvizice. V oblasti molekulární biologie získala společnost Roche technologii LightCycler jako další platformu pro PCR v reálném čase. Současně se stěhováním došlo k reorganizaci firemních struktur na všech stupních řízení a byla vytvořena dlouhodobá strategie rozvoje farmaceutické a diagnostické divize s předpokládaným odprodejem Roche Public Health a Fragrancies.

Budova TEGIMENTA AG v Rotkreuzu, součást skupiny ROCHE

Další krok: Automatizace

Testy Amplicor a Amplicor Monitor se plně osvědčily v klinické praxi a nalezly své pevné místo v diagnostických laboratořích několika kontinentů. Jednou z mála ekonomicky vyspělých zemí, kde měly stále status experimentálních, byly USA. Složitá a  zdlouhavá procedura schvalování americkou FDA znamenala, že se na americký trh s diagnostiky dostávaly v průměru o tři roky později oproti Evropě. Významným posunem bylo povolení FDA k použití souprav pro testování léků proti HIV, kde se plně osvědčily a  sehrály významnou roli v  ověřování účinků antivirotik.

I když mikrodestičkový formát testů byl připraven velmi sofistikovaně, hands-on time v laboratoři byl poměrně vysoký, s mnoha pipetovacími kroky, provádění testů vyžadovalo vysokou míru soustředění pracovníků laboratoře. Proto jsme při školení doporučovali pracovat ve dvou se vzájemnou kontrolou správnosti postupu.  
Ve firmě Roche si toho byli vědomi a rozhodli se využít umu svých švýcarských vývojářů, prověřeného kvalitou biochemických a  imunochemických analyzátorů na  trhu známých pod značkou COBAS®, a zadali jim vývoj automatického analyzátoru pro PCR. V koncernovém podniku TEGIMENTA AG v Rotkreuzu u Luzernu nezklamali a vyvinuli unikátní přístroj pro automatickou amplifikaci nukleových kyselin a detekci amplikonů. Podmínkou vývoje bylo, že potřeba dodatečných plastových kontejnerů, zkumavek a špiček nepřesáhne hodnotu 1 USD na test. Podmínka byla splněna díky využití stávajících plastových kontejnerů a zkumavek používaných v analyzátorech COBAS® a vyráběných v obrovském množství. Jediný nový plastový výrobek byl tzv. A-ring, kruhový držák 12 amplifikačních zkumavek o objemu 100 µl s držákem pro unikátní čárový kód.

COBAS® AMPLICOR byl velmi povedený stroj. Zahrnoval 2 nezávisle programovatelné cykléry Peltierova typu, každý o 12 pozicích pro amplifikační zkumavky. Ty bylo možno programovat buď pouze pro amplifikaci, v tom případě skončil proces denaturací amplikonů, nebo i pro následnou detekci – v tomto případě po denaturaci následovala detekce amplikonů, tedy vyhodnocení celé reakce. První způsob se používal při využití jedné nebo obou tzv. detekčních pozic – A-ring se vyjmul z cykléru a přemístil do DP – zde na něm pokračovala detekce, zatímco v cykléru již probíhal další test. Za účelem detekce stroj přenesl 25 µl amplifikovaného vzorku do detekční zkumavky v zásobníku a  dávkovací jehlou, dokonale promývanou po každém kroku, přidával potřebné reagencie z reagenčních kazet. Přenosovým ramenem pak jednotlivé zkumavky přemisťoval ze zásobníku do inkubátoru, promývačky, optického denzitometru dle přesného algoritmu. Sumárně lze říci, že stroj umožňoval provedení testů Amplicor na 12 infekčních agens a provedení 5 typů kvantitativních testů Amplicor Monitor. Současně mohly probíhat až 4 různé testy. 

Při optimálním využití byla kapacita 72 vzorků za směnu. Kvůli snímání čárových kódů na reagenčních kazetách, A-rinzích apod. byl stroj vybaven čtečkou čárových kódů. Ovládat se dal buď přímo za použití membránové klávesnice a dvouřádkového černobílého (spíš černozlatého) LCD displeje, nebo, později, prostřednictvím osobního počítače s nainstalovaným softwarem AmplilinkTM. Takto bylo možné připojit a ovládat až 3 stroje. Nutným příslušenstvím byla tiskárna, nejprve připojená přes paralelní port přímo ke stroji, později pak k počítači. Stroj měl 2 kanystry – jeden na promývací pufr (ředil se před použitím 1 : 9), druhý na tekutý odpad. Jednalo se tedy o uzavřený systém, který se vešel na desku běžného laboratorního stolu. Neoplýval futuristickým designem. Na jedné z výstav stál shodou okolností vedle imunochemického analyzátoru HITACHI, který navrhoval proslulý italský designer Luigi Colani. Obdiv k Hitachi však vydržel jen do spuštění – naprosto přesné pohyby analyzátoru COBAS velmi kontrastovaly s obdobnými pohyby třesoucího se Hitachi. Celkem bylo vyrobeno a instalováno téměř 15 000 strojů, část z nich slouží dodnes.

Oficiální představení COBAS® AMPLICOR – Amsterdam

10. a 11. října 1995 se v amsterdamských hotelech Renaissance a  Golden Tulip Barbizon Palace konalo oficiální představení automatického systému COBAS® AMPLICOR a technologie PCR v souvislosti s uvedením na evropský trh. Akce nebyla určena pouze pro odbornou veřejnost, ale zahrnovala i tříhodinovou tiskovou konferenci pro média. Účastníkům z řad odborníků i laiků se zde představili prezidentka Roche Molecular Systems Kathy Ordoňez, vedoucí diagnostické divize Roche a člen exekutivy Jean-Luc Bélingard, Thomas White, viceprezident RMS pro výzkum a vývoj, a všichni členové evaluačních týmů, jejichž vedoucí představili evaluační studie v odborném programu. Novináři získali profesionálně zpracované marketingové podklady. Pro zákazníky Roche to byla vítaná příležitost k oficiálním i kuloárním diskusím s tvůrci technologie.

And do you have distilled water in your lab?

Přechod z manuální verze Amplicor HCV na  automatizovanou COBAS® AMPLICOR HCV se neobešel bez problémů. Zdálo by se, že stačí reagencie pouze zabalit do odpovídajících kontejnerů – ale ouha! Plně spolehlivý test začal v automatické verzi zlobit. Provedli jsme tedy paralelní testy obou verzí na archivním panelu našich pacientů. Výsledková loterie automatické verze nás velmi nemile překvapila. Začalo tedy konzultační kolečko s firmou – v Basileji nevěděli a odkázali nás na konzultační středisko Roche Diagnostic Systems v Branchburgu v New Jersey. Počkali jsme tedy na začátek pracovní doby v Americe (s 6hodinovým časovým rozdílem). Zhruba 5 minut trvalo, než nás přepojili na správnou linku, dalších 10 minut zabralo podrobné vysvětlování problému. Pak se ve sluchátku ozvalo: „Could you repeat it once more, so I am pretty sure, what is your problem?“ Dalších 10 minut hovoru. „Now let me repeat your problem, so we are sure in understanding each other.“ To trvalo 15 minut. A po vzájemném odsouhlasení se ozvalo: „And do you have distilled water in your lab?“ Naštěstí pro nás se o několik dnů později ocitl ve  stejné situaci profesor Harald Kessler z univerzity v rakouském Grazu. Toho se neptali na destilovanou vodu, ale poslali k vyřešení dr. Betty Dragon a dr. H. Dreismanna, členy evaluačního týmu testů COBAS® AMPLICOR HCV a HCV Monitor. Tak jsme se všichni sešli v Grazu. Ukázalo se, že některé reagencie byly stabilní, pokud byly vyjmuty z lednice, odebralo se z nich příslušné potřebné množství a opět byly do chlazeného prostoru vráceny. Když však měly být v kazetě několik hodin denně vloženy do přístroje při teplotě mnohdy vyšší než pokojové, jejich stabilita byla podstatně nižší. Problém byl vyřešen v řádu týdnů.

V Grazu jsme se toho roku sešli ještě jednou, a to v létě. V parných letních dnech se totiž projevila jediná slabina stroje. V neklimatizovaných prostorách při plném obsazení cyklérů a detekčních pozic docházelo při multiplexní detekci k přehřívání pracovního prostoru, čímž se zkracovaly potřebné inkubační doby a stroj nestíhal přemisťovat zkumavky. Řešení bylo trojí: New Jersey: umístění COBASů do klimatizovaných prostor a  přeprogramování jako one-button-machine, kdy personál mačká pouze tlačítko Start. Graz: led z výrobníku umístěný do igelitových pytlů, jimiž byl stroj obložen. Praha: spouštění výhradně ve večerních a nočních hodinách za odpovídající teploty okolí.

 Přístroj COBAS® AMPLICOR

Stroj, který mě neměl rád

Nejsem teolog, proto nedokážu posoudit, zda mikroprocesorem řízené přístroje mohou mít cosi jako duši. Do naší laboratoře dodaný COBAS® AMPLICOR byl první v  obou republikách i  jeden z prvních v Evropě. Byl vyroben v rámci první „ostré“ série, vybaven příslušenstvím a manuálem 3. revize z 6. 9. 1995. Než přišel do distribuce, proběhl upgrade softwarové karty a 4. revize manuálu 20. 11. 1995. U přístroje nacházejícího se aktuálně ve  Vídni byla softwarová karta vyměněna, manuál nikoliv. Když jsme jej s dr. Pavlem Henčlem přebírali, byl v naší přítomnosti přezkoušen, před odpoledním koncem směny zabalen a naložen do kufru služební Mazdy 626. Krátce před půlnocí jsme s ním po nevalně ošetřených zimních silnicích doklouzali do Prahy. Následující den jsme jej po instalaci a přípravě vzorků pro test na konci pracovní doby spustili. Akce zůstala ve stadiu pokusu. Postupovali jsme podle manuálu, stroj reagoval naprosto odlišně. Podotýkám, že servisní technik pro ČR neexistoval, neboť pan Ing. Ivan Šturm nebyl pro tuto techniku ještě proškolen. Po několika hodinách marného snažení a výbuchů vzteku, pro zachování celistvosti zařízení naštěstí asynchronních, jsme zavolali rakouského servisního technika Horsta Schiffrera, který nás po telefonu dle nové verze manuálu naváděl a dovedl k úspěchu. Mobilní operátoři obou zemí měli ten den příjmové žně.

Po uvedení analyzátoru do pravidelného diagnostického provozu jsme zaznamenali vyšší poruchovost. Některé závady v manuálu popsány byly, značnou část jsme popisovali poprvé, přičemž šlo o poruchy celosvětově unikátní. Nutno říci, že ať operátorem byla kterákoli z mých kolegyň, vždy jsem byl v laboratoři přítomen. Pokud se pan Ing. Šturm dostavil v mé nepřítomnosti, stroj přezkoušel, spustil a ten běžel bez závad jako pověstné švýcarské hodinky. To se několikrát opakovalo. Nakonec jsme se s panem inženýrem konečně sešli v laboratoři. Spustil jsem přístroj, ten se rozběhl, ohlásil unikátní závadu a ukončil pokus. Vtom se ozval Ing. Šturm: „Pane doktore, tři metry od stroje a opovažte se přiblížit.“

Stroj restartoval a ten běžel zcela bez závad. „Vyzařujete zřejmě silné magnetické pole, které ho ruší. Nedá se nic dělat, nesmíte k němu.“ Nevím, zda jsem takový zářič. Za svou kariéru u firmy jsem pracoval s desítkami jiných kusů tohoto typu, řadu z nich jsem sám instaloval, u žádného jiného stroje se něco podobného nevyskytlo. Zmíněný stroj u nás sloužil v rutinním provozu 8 let, pak byl vrácen do výrobního závodu, kde byl repasován a podle zpráv, které mám, sloužil ještě v roce 2012 a byl prakticky bezporuchový. Sám pro sebe mám jediné vysvětlení – z úvodního dne v naší laboratoři si zřejmě pamatoval, že jsem jej v návalu vzteku z beznaděje chtěl rozbít kladivem.

Změna strategie zákaznické podpory

Postupné zavádění analyzátorů COBAS® AMPLICOR do praxe vedlo ke změně strategie zákaznické podpory. Společné kurzy ztratily postupně svůj význam. Nastala doba cestování. Zaškolení obsluhy se provádělo současně s instalací technologie v laboratoři zákazníka. To mělo své výhody i nevýhody. Nespornou výhodou bylo, že jsme poznali laboratoř, její prostorové podmínky i kvalitu práce zaměstnanců. Zavedly se telefonické konzultace. S manuálně zručnými zákazníky se daly zvládnout i některé servisní úkony. 

Pamatuji si např. na úspěšnou výměnu dávkovací jehly ve  virologické laboratoři v  Brně-Bohunicích s  telefonickou navigací. Nevýhodou byl naopak delší čas strávený na cestách, a to jak v obou republikách, tak v  zahraničí. Nemohu zde nevzpomenout party nadšených propagátorů nových technologií v pražské kanceláři Roche – RNDr. Tomáše Petra, RNDr. Milana Richtra, Ing. Ivana Šturma, Alexandry Bauersfeldové a – po spojení s Boehringerem – MUDr. Igora Blanárika a Mgr. Dalimila Žůrka, kteří odváděli skvělou práci. MUDr. Pavel Henčl se stal velmi úspěšným PCR managerem v rámci celé Evropy. Vzpomínám si na škádlení s našimi německými kolegy, kde distribuce COBASů zpočátku vázla, že pro ně budeme v případě potřeby vyšetřovat v rámci přeshraniční spolupráce, protože my v Ústí nad Labem systém máme, zatímco oni v Drážďanech ne. Pak jich ovšem během několika měsíců umístili 80, což vzhledem k počtu obyvatel SRN vcelku odpovídalo našim 14.

Kurzy PCR pokračují

COBAS® AMPLICOR, pohled na pracovní plochu
1 Dva dvanáctipozicové cykléry s otevřenými víky, v dolním založen amplifikační kroužek (A-ring) na pravé straně označený unikátním čárovým kódem. Mezi cykléry jsou dvě čekací pozice pro detekci již amplifikovaných A-ringů.
2 Pohyblivé rameno s pipetovací jehlou pro přesné pipetování vzorků a reagencií, v průzoru je patrný promývací a dekontaminační blok pro jehlu a pod ním směrem ke zkumavkám je vidět hranol pro kontrolu deviace a ev. ukapávání jehly. V pravé části pohyblivého ramene je mechanický úchop pro přenášení zkumavek.
3 Kontaktní termostatický inkubační blok 37 °C.
4 Promývací stanice pro zkumavky s přívodními a odsávacími hadičkami.
5 Šachta optického denzitometru se zdrojem záření 660 nm.
A Stojánky s reagenčními kazetami obsahujícími specifické sondy s magnetickým jádrem vložené na třepačku.
B Zásobníky detekčních zkumavek.
C Stojánek s reagenčními kazetami obsahujícími generické reagenty pro detekci. Stojánky s reagenčními kazetami se po skončení detekce vyjímaly a ukládaly při +4 °C až +8 °C v lednici.

Molekulárně biologické techniky se v mikrobiologické diagnostice prosadily natolik, že byly zařazeny do specializační přípravy v oboru lékařská mikrobiologie.

 COBAS® AMPLICOR – přístroj s jednoduchou obsluhou:
1. Vložte A-ringy do příslušných cyklérů. V programu Load sejměte nejprve čárový kód cykléru, poté kód A-ringu.
2. Vložte stojánky s reagenčními kazetami a načtěte čárové kódy v pořadí kód pozice stojánku, kód kazety.
3. Vložte stojánky s příslušným počtem detekčních zkumavek.
4. V programu Order načtěte čárové kódy požadovaných testů.
5. Stiskněte tlačítko Start a počkejte na výsledek samokontroly přístroje. Pak můžete odejít.
6. Výsledky najdete v protokolu v tiskárně. 

V ČR se tak stalo počínaje rokem 1999. Byl jsem osloven vedením katedry mikrobiologie Institutu pro postgraduální vzdělávání ve zdravotnictví, zda by bylo možné zorganizovat kurz v rámci předatestační přípravy. Teoretická část školení nepředstavovala problém, zdrojů bylo k dispozici dost. Bylo však evidentní, že praktická část leží mimo možnosti financování ze strany IPVZ. Oslovili jsme proto všechny dodavatele molekulárně biologických metod a potřeb pro ně na českém trhu s nabídkou možnosti praktické prezentace jimi dodávaných systémů výměnou za poskytnutí technologie a reagencií pro kurz. 1. LF UK poskytla výukové laboratoře na ÚIM, naše laboratoř archivní vzorky. Účastníci kurzu tak měli výjimečnou příležitost poznat rozdílné technologie a vlastníma rukama je vyzkoušet. Témata se přednášela v rámci postgraduální výchovy lékařů-mikrobiologů i v dalších zemích. Učil jsem postupně v obdobných institucích v Estonsku, Lotyšsku, Maďarsku, Ázerbájdžánu a  Srbsku. Pozorovat vývoj v  těchto postkomunistických zemích bylo zajímavé, ne vždy však příjemné. Dovolte mi proto podělit se s vámi, čtenáři, o osobní vzpomínku.

Ve  druhé polovině devadesátých let na Balkánském poloostrově opět umírali lidé ve válečném konfliktu. Nezvládnuté rozdělení jugoslávské federace po  XIV. sjezdu SKJ, tajné Koraďorděvské dohody mezi prezidenty Tudžmanem a Miloševičem o rozdělení území Bosny a Hercegoviny mezi Chorvatsko a Srbsko, vlna nacionalismu zkomplikovaná náboženským fanatismem, to vše vedlo v dubnu 1992 k vypuknutí prvního konfliktu – občanské války, která v průběhu 3 let stála životy 65 000 Bosňanů, 25 000 Srbů a téměř 8 000 Chorvatů. V dalším konfliktu šlo o demontáž zbývající jižní části Jugoslávie, zahrnující Srbsko, Černou Horu a Makedonii. Hlavním jevištěm se stala albánská autonomní oblast v Srbské republice – historické území Kosovo Polje.

Humanitární bombardování a kolaterální škody

Tento konflikt již nebyl jen občanskou válkou uvnitř země. Byly v něm přítomny mezinárodní bezpečnostní síly – KFOR, ale i  další vojska NATO. Neposlušné Srbsko odmítlo vyhlášení samostatnosti Kosova. Následovala ekonomická blokáda země a nakonec v roce 1998 došlo k bombardování jejího území, pro něž český prezident Václav Havel vymyslel termín „humanitární bombardování“. Termín „kolaterální škody“ je znám od války v  Perském zálivu a  označuje následky trefy do nezamýšleného cíle (což se u první války v přímém televizním přenosu dalo těžko utajit).

Staré latinské přísloví praví: „Inter arma silent musae.“ O byznysu to neplatí. Ostatně – řada válek v minulosti byla vedena právě na jeho podporu. Takže není divu, že expanzi PCR nezastavily ani válečné konflikty, ani hospodářské blokády. Necelý týden po neslavném konci humanitárního bombardování Bělehradu, jež náhle ustalo poté, co vznikla kolaterální škoda na budově velvyslanectví Čínské lidové republiky, sedím v letadle do Bělehradu. Let byl klidný, přistání na letišti Nikoly Tesly také. Cesta autem do hotelu skrz Novi Beograd je navzdory dopravní špičce plynulá. Před nájezdem na most přes Sávu pohlédnu doleva: výšková budova bývalého ústředního výboru Svazu komunistů Jugoslávie, dominanta této části města, sice stojí, někde kolem 20. poschodí má však 2 vyhořelá podlaží, do nichž zeje díra. Řidič mne informuje, že jde o zásah do televizního studia, které vlastnila dcera prezidenta Miloševiče. Chápu, tohle byl zamýšlený cíl. Přejíždíme most přes řeku Sávu a před tunelem zahýbáme a stoupáme do svahu. V Bělehradě jsem již poněkolikáté, pamatuji se, že nyní přijde čtvrť s bloky veřejných budov. Místo části jednoho bloku zbořeniště. „Co to je?“ ptám se. „Kolaterální škoda,“ zní odpověď. „Dobře, tak co to bylo?“ „Dětská nemocnice.“ „Jak se jim to povedlo?!“ „Blok odtud je ministerstvo vnitra – typická kolaterální škoda.“

Nejsem ani pacifista, ani militarista. Zdůvodnění nutnosti útoku mohu věřit, nebo o něm pochybovat, nicméně jedno vím jistě: rodinám zdravotníků, kteří se nevrátili toho dne ze služby, a už vůbec rodičům dětí svěřených k léčbě, kteří je už nikdy neuvidí, bych termíny humanitární bombardování a kolaterální škody vysvětlovat opravdu nechtěl.

MUDr. Emil Pavlík, CSc.

MUDr. Emil Pavlík, CSc.


Absolvent FVL UK v Praze 1980, obor Všeobecné lékařství, atestace z lékařské mikrobiologie II. stupně 1998, licence ČLK pro vedoucího lékaře-primáře 2000, CSc., v oboru Genetika 2001, školitel PGS v doktorském studijním programu FBMI.

Ústav imunologie a mikrobiologie 1. LF UK a VFN, Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN v Praze, Katedra zdravotnických oborů a ochrany obyvatelstva FBMI ČVUT Kladno.

Literatura
  1. Advancing the Revolution in Molecular Diagnostics – a backgrounder on polymerase chain reaction (PCR), The Mind´s Eye Inc. Stamford 1994
  2. COBAS® AMPLICOR™ Automating PCR for the Clinical Laboratory, F. Hoffmann-La Roche Ltd. 1999
  3. COBAS® AMPLICOR™ OPERATOR´S MANUAL Roche Diagnostic Systems 1997
  4. AMPLILINK™ Roche Diagnostics 1997
  5. COBAS® AMPLICOR™ QUICK REFERENCE GUIDE version 3.0 Roche Diagnostics 1998
  6. Amplicor™ News PCR Diagnostics – Podklady pro tiskovou konferenci 11. 10. 1995 v Amsterdamu
  1. Clinician Vol. 16 No.6 November 1998 Gardner-Caldwell Communications ISSN 0264-6404
  2. Amplicor™ EV Enterovirus Roche Diagnostic Systems 1994
  3. Amplicor™ CMV F.Hoffmann-La Roche 1998
  4. Benchmark Vol. 3 No. 1 pp. 12 – 19, 1996. ISSN 1354-2885
  5. Archiv autora
Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.