Úvod

SARS-CoV-2 (z angl. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) je virus s vnějším obalem a jednovláknovou RNA z čeledi Coronaviridae. Koronaviry mají podobnou strukturu a jsou tvořeny 16 nestrukturálními a 4 strukturálními proteiny: hrotovým „spike“ (S) proteinem, proteinem obálky (E), membránovým (M) proteinem a nukleokapsidovým (N) proteinem. Koronaviry způsobují onemocnění, jehož symptomy sahají od příznaků mírné chřipky až po závažnější příznaky typické pro onemocnění koronavirem 2019 (COVID-19), způsobeného virem SARS-CoV-2.^1,2

SARS-CoV-2 se přenáší mezi lidmi převážně prostřednictvím kapének z dýchacích cest, přičemž je možný také nepřímý přenos prostřednictvím kontaminovaného povrchu.^3,4,5,6 Virus vstupuje do hostitelských buněk pomocí angiotenzin konvertujícího enzymu 2 (ACE2), který se vyskytuje zejména v plicích.^7,8

Inkubační doba onemocnění COVID-19 je 2–14 dnů od expozice nákaze, přičemž se ve většině případů příznaky projeví přibližně za 4–5 dnů od expozice.^3,9,10 Škála symptomů nákazy sahá od příznaků mírné chřipky (horečka, kašel, únava, ztráta čichu, zhoršené dýchání) až po příznaky velmi závažné.^11,12 U většiny symptomatických pacientů však není průběh onemocnění vážný, k závažnému průběhu dochází zejména u starších dospělých nebo u dospělých, kteří trpí jinými zdravotními problémy a vyžadují intenzivní péči. U pacientů s vážným onemocněním je hlavní komplikací syndrom dechové tísně dospělých (ARDS). U pacientů v kritickém stavu typicky dochází např. k respiračnímu selhání, šoku anebo multiorgánové dysfunkci, nebo ke kolapsu.^11,13,14

Konečná diagnóza onemocnění COVID-19 spočívá v přímé detekci SARS-CoV-2 RNA technikou amplifikace nukleových kyselin (NAAT).^21,22,23 Imunochemické metody, které stanovují protilátky proti SARS-CoV-2, mohou přispět k identifikaci osob, u nichž se v minulosti vyskytla nákaza, a zhodnotit rozsah expozice populace, a tím pomoci v rozhodování o používání, vynucování nebo uvolňování opatření k zamezení jejího šíření.²⁴

Přímá a nepřímá diagnostika SARS-CoV-2

Při podezření na infekci by měl být rychle odebrán a testován vzorek z horních cest dýchacích. Lze provádět výtěr z nosohltanu (preferováno) nebo výtěr z orofaryngu nebo výtěr z nosu. Vše pomocí speciální odběrové sady. Testování vzorků z dolních cest dýchacích je také doporučováno (sputum, bronchoalveolární laváž, endotracheální aspirát).^4,49

Metoda NAAT¹⁵
Pro diagnostiku viru SARS-CoV-2 doporučuje WHO přímé stanovení virové RNA v odebraném vzorku pomocí amplifikačních testů (NAAT – Nucleic Acid Amplification Tests). Nejpoužívanější metodou je rRT-PCR (Real-time reverse transcription polymerase chain reaction), tedy PCR s reverzní transkripcí v reálném čase, která umí detekovat specifické sekvence virové RNA. Konkrétně se jedná o detekci genů E a RdRP. Validovaný diagnostický postup pro detekci viru SARS-CoV-2 dle WHO uvádí: (a) primární screening: detekce genu E, (b) potvrzující screening: detekce genu RdRP. Tzn. pozitivní detekce jednoho genu by měla být potvrzena druhým rRT-PCR testem zaměřeným na jiný gen viru SARS-CoV-2.⁴⁹ Roche portfolio pro molekulární diagnostiku představuje několik možností PCR v reálném čase (rt-PCR).

Vyšetření protilátek⁵
Sérologické testy stanovující protilátky proti viru SARS-CoV-2 nejsou v současné době doporučovány pro diagnostiku COVID-19. Důvodem je jejich limitovaná výpovědní hodnota v akutní fázi infekce, protože protilátky vznikají až za určitou dobu po nákaze (obvykle za 7–10 dní).⁴⁹ Protilátkový test se nejvíce využívá k určení imunitní reakce a séroprevalence. Roche nabízí metodu kvalitativní detekce protilátek IgG a IgM na přístrojích řady cobas e.

Vyšetření antigenu^6,7
Testy detekují SARS-CoV-2 antigen prakticky ve stejných typech vzorků jako molekulární test. Tyto typy testů mají dobrou specificitu, ale ve srovnání s NAAT omezenou citlivost. Výhodami jsou téměř okamžitý výsledek a nižší náklady ve srovnání s NAAT.⁴⁹ Roche bedlivě sleduje vývoj a potřeby zdravotnického systému v boji s epidemií. Díky tomu a své silné pozici ve vývoji inovativních diagnostik přináší potřebné prostředky adekvátní dané situaci.

Více aktuálních informací naleznete na: 
https://www.ifcc.org/ifcc-news/

Přímý průkaz SARS-CoV-2 molekulárně biologickou metodou PCR v reálném čase (rt-PCR)

WHO doporučuje pro diagnostiku SARS-CoV-2 metody přímého stanovení virové RNA pomocí amplifikačních metod. Laboratorní diagnostika SARS-CoV-2 je založena na průkazu virové RNA pomocí molekulárně biologické metody PCR v reálném čase (rt-PCR). 

Odběry pro detekci SARS-CoV-2:

• nasofaryngeální a orofaryngeální stěr;
• sputum (nedoporučuje se indukce sputa);
• endotracheální aspirát;
• bronchoalveolární výplach (BAL).

Roche možnosti laboratorní diagnostiky metodou NAAT:

1. použít navazující automatické diagnostické přístroje, tzn. přístroje pro izolaci virové RNA a přístroje pro detekci SARS-CoV-2 pomocí PCR v reálném čase (rt-PCR). Izolaci virové RNA z různých odběrových materiálů lze provést pomocí přístrojů z řady MagNA Pure, konkrétně na systémech MagNA Pure 24 a MagNA Pure 96, a návazně provést detekci SARS-CoV-2 pomocí rt-PCR přístrojů v kombinaci s příslušnými MasterMixy, kontrolami a LightMix^® kity. LightMixy pro konkrétní geny jsou od společnosti TibMolBiol a jsou validované pro různé typy těchto přístrojů, např. LightCycler^® 480, LightCycler^® 96 a cobas z 480. Společnost Roche, Diagnostics Division, ve spolupráci se společností TIB Molbiol (GmbH, Germany) nabízí testy, které jsou v souladu s doporučeními WHO pro detekci virové RNA. LightMixy detekují vybrané oblasti genu E nebo genu RdRP (RNA-dependentní RNA polymerázy). Pro screening jsou určeny kity pro detekci genu E k prokázání SARS-CoV-1 a SARS-CoV-2 spolu s dalšími viry příbuznými SARS. Pro potvrzení je určen kit pro detekci genu RdRP (RNA-dependentní RNA polymerázy) k potvrzení přítomnosti SARS-CoV-2 ve vzorku.
2. pomocí manuálních izolačních kitů pro izolaci virové RNA, konkrétně lze použít kity HighPure Viral RNA Acid Kit a HighPure Viral NA Kit. Následně pak provést detekci SARS-CoV-2 pomocí rt-PCR přístrojů v kombinaci s příslušnými MasterMixy, kontrolami a LightMix kity.
3. použití automatického velkokapacitního diagnostického systému pro kompletní analýzu vzorků cobas^® 6800. V jednom přístroji probíhá izolace virové RNA a následně také detekce SARS-CoV-2 pomocí metody PCR v reálném čase (rt-PCR) bez nutnosti manuální intervence uživatele.

Více informací o přístrojích řady 
MagnaPure a manuální izolační kity: https://www.lifescience.roche.com/ 
LightCycler^®: https://lifescience.roche.com/ 
cobas^® 6800: https://diagnostics.roche.com/ 
Konkrétní postupy a aktuální návody naleznete na portálu dialog.roche.com v sekci eSlužby/COVID-19

cobas® 6800 – automatický velkokapacitní diagnostický systém pro kompletní analýzu vzorku

Diagnostický systém cobas^® 6800 využívá pro přímou diagnostiku COVID-19 tzv. duální test cobas^® SARS-CoV-2, který detekuje dvě oblasti genomu SARS-CoV-2 (geny E a ORF1a/b) pro maximální specificitu. Test je certifikován EUA/CE-IVD. Kapacita systému je 1 440 vzorků denně (24hodinový pracovní provoz).

Požadavky na testování cobas® SARS-CoV-2: 
• min. objem vzorku: 600 μl; 
• typ vzorku: nasofaryngeální nebo orofaryngeální stěr; 
• zkumavky:

• cobas^® PCR Media tubes, cobas^® PCR Media Dual Swab Kit, cobas^® PCR Media Uni Swab kit – tyto zkumavky lze použít bez nutnosti přenosu vzorku do sekundární zkumavky, čímž se snižuje riziko kontaminace;
• Copan UTM-RT System, BD Universal Viral Transport Systém – zkumavky s nutností přenosu vzorku do sekundární zkumavky.

Charakteristika systému cobas^® 6800:

• flexibilní, vysokokapacitní, plně automatizovaný systém pro izolaci nukleových kyselin s následnou amplifikací a detekcí infekčního agens (vše v jednom přístroji); minimalizuje nutné manuální kroky spojené s obsluhou;
• lze propojit s preanalytickými systémy a jedno- nebo oboustranně integrovat s různými typy LIS;
• v jednom běhu je možné provádět současně až 3 různé testy z jednoho vzorku;
• v jednom běhu lze měřit až 96 vzorků, včetně pozitivní a negativní kontroly;
• díky statimovému vstupu lze rychle a přednostně měřit vzorky s vysokou prioritou.

Portfolio testů systému cobas® 6800: 
• test pro SARS-CoV-2; 
• testování vzorků dárců krve a krevních složek:

• MPX test pro HIV, HCV, HBV;
• DPX test pro parvovirus B19 a HAV;
• CHIKV/DENV/Testy WNV, HEV;

• pohlavně přenosné choroby: 

• HPV, CT/NG, TV/MG;

• infekční choroby a monitorování virové nálože:

• HIV-1, HBV, HCV, CMV, HIV-1/2 Qual

• transplantační vyšetření: 

• EBV, BKV.

Doba trvání testu: první výsledky (96 vzorků) do 3,5 hod. od vložení do systému, každých dalších 90 min. přístroj generuje vždy dalších 96 výsledků.

Nepřímá diagnostika SARS-CoV-2 metodou kvalitativního stanovení protilátek

Elecsys^® Anti-SARS-CoV-2 je plně automatizovaná imunochemická metoda pro in vitro stanovení protilátek (včetně IgG) proti viru SARS-CoV-2 v lidském séru a plazmě na analyzátorech řady cobas e. V rámci testu je použit rekombinantní protein, který reprezentuje nukleokapsidový (N) antigen, ve formátu sendvičového testu s dvojitým antigenem, jenž zvýhodňuje detekci vysoce afinitních protilátek proti SARS-CoV-2. Metoda umožňuje detekovat hladiny protilátek, které pozitivně korelují s neutralizačními protilátkami používanými v neutralizačních testech.^43,44 Cílem testu je určení imunitní reakce na SARS-CoV-2.⁴⁵

Imunitní odpověď při infekci koronavirem²
Při nákaze virem SARS-CoV-2 probíhá v těle hostitele imunitní reakce proti viru, která zahrnuje produkci specifických protilátek proti virovým antigenům. Protilátky typu IgM a IgG jsou zjištěny již 5 dnů po propuknutí příznaků.25,26 Medián sérokonverze je u IgM protilátek pozorován po 10–13 dnech a u IgG protilátek po 12–14 dnech od propuknutí příznaků,^27,28,29  přičemž maximální hladiny protilátek jsou zjištěny ve 2. až 3. týdnu (IgM), ve 3. až 6. týdnu (IgG) a ve druhém týdnu v případě celkových protilátek.^{25,26,27,28,29,30,31}

Zatímco protilátky typu IgM přibližně v 6. až 7. týdnu vymizí,^32,33 u protilátek typu IgG je naopak v této době pozorována vysoká séropozitivita.^25,32,33 I když je IgM obvykle hlavním typem protilátek vylučovaných do krve v raných fázích primární protilátkové odpovědi, úrovně a chronologické pořadí IgM a IgG protilátek se zdají být u SARS-CoV-2 viru vysoce variabilní. IgM a IgG protilátky proti viru SARS-CoV-2 se často objevují současně a v některých případech bylo vypozorováno, že se protilátky typu IgG objevily před IgM protilátkami, což omezuje jejich diagnostické použití.^{26,27,29,34,35}

Po nákaze nebo očkování schopnost protilátek vázat antigen postupem času roste – tento proces se nazývá afinitní zrání.³⁶ Vysoce afinitní protilátky mohou vyvolávat neutralizaci tím, že rozpoznávají a vážou konkrétní virové epitopy.^37,38 Při nákaze virem SARS-CoV-2 se protilátky proti hrotovým (S) a nukleokapsidovým (N) proteinům, které vykazují vysokou neutralizační schopnost, vytváří již od devátého dne. Tento fakt naznačuje, že sérokonverze může vést k ochraně organismu alespoň po omezenou dobu.^{34,39,40,41,42}

Elektrochemiluminiscenční imunoanalýza (ECLIA)
Princip testu: sendvičový test s dvojitým antigenem (celková doba stanovení: 18 minut)³³

Krok 1 (9 minut) 
Inkubace 20 μL* / 12 μL** vzorku odebraného pacientovi se směsí biotinylovaného a ruthenylovaného nukleokapsidového (N) antigenu. Za přítomnosti příslušných protilátek se vytvoří sendvičový double-antigen imunokomplex (DAGS).

* cobas e 411, e 601/602, ** cobas e 801

Krok 2 (9 minut) 
Přidané mikročástice potažené streptavidinem se pevně navážou na komplexy DAGS interakcí biotinu a streptavidinu.

Krok 3 (měření) 
Reakční směs je přenesena do měřicí cely, kde jsou mikročástice magneticky zachyceny na povrchu elektrody. Poté dojde k odstranění nenavázaných mikročástic. Přivedené napětí na elektrodě vyvolá chemiluminiscenční emisi, která je změřena fotonásobičem. Velikost signálu odpovídá vzestupu titru protilátek.

Elecsys^® Anti-SARS-CoV-2 – analytické vlastnosti metody

Senzitivita sérokonverze⁴⁵
Po uzdravení z nákazy, které bylo potvrzeno negativním výsledkem PCR, bylo za pomoci testu Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 vyšetřeno 
26 následně odebraných vzorků od pěti osob.

Klinická senzitivita⁴⁵
Testu Elecsys^® Anti-SARS-CoV-2 bylo podrobeno celkem 496 vzorků od 102 pacientů s příznaky onemocnění, u nichž PCR test potvrdil nákazu virem SARS-CoV-2. Po potvrzení pozitivního výsledku PCR testu byl od těchto pacientů získán v různých časových intervalech jeden či více po sobě jdoucích vzorků.

Klinická specifičnost⁴⁵
Celková specifičnost ve skupině 792 potenciálně zkříženě reaktivních vzorků byla 99,5 % (95 % CI = 98,63–99,85 %).

Klinická specifičnost⁴⁵
Metodou Elecsys^® Anti-SARS-CoV-2 bylo otestováno celkem 10 453 vzorků z rutinních vyšetření a od dárců krve, které byly získány v době před prosincem 2019.

Korelace s neutralizací séra⁴⁵
U 46 klinických vzorků od jednotlivých pacientů bylo provedeno porovnání metody Elecsys^® Anti-SARS-CoV-2 s neutralizačním testem založeným na VSV (vesicular stomatitis virus) pseudovirovém systému.⁴⁶

Informace k objednání

Roche s.r.o., Diagnostics Division 
Na Valentince 3336/4, 150 00 Praha 5 
www.roche-diagnostics.cz