V říjnu minulého roku uvedla firma Roche ve spolupráci s firmou Sekisui druhou generaci metody Mediace® RPR 2 pro stanovení nespecifických netreponemových protilátek v lidském séru nebo plazmě.

Úvod do problematiky, situace v ČR

Původcem syfilis je intracelulární gramnegativní bakterie, spirocheta Treponema pallidum subspecies pallidum. Syfilis, nebo také příjice či lues, je infekční systémové onemocnění s charakteristickým střídáním příznakového a bezpříznakového období. Bakterie Treponema pallidum subsp. pallidum (TPP) se nedá in vitro kultivovat, což negativně ovlivňuje přímý průkaz bakterie. Přímé testy (vč. PCR) jsou vhodné prakticky pouze v situaci, kdy lze přítomnost TPP očekávat. Z tohoto důvodu má svou nezastupitelnou roli nepřímá diagnostika, při níž se prostřednictvím sofistikovaných metod prokazuje přítomnost specifických a nespecifických protilátek v séru, plazmě a likvoru. Sérologické testy jsou v diagnostice syfilis metodou volby a k dispozici je řada treponemových a netreponemových testů. Treponemové metody přímo detekují specifické protilátky proti proteinům T. pallidum, zatímco netreponemové testy prokazují přítomnost nespecifických antikardiolipinových protilátek.¹  

Vyšetření na syfilis není v ČR indikováno vzhledem k povaze onemocnění pouze klinickým podezřením, ale je také specifikováno vyhláškou č. 306/12 Sb., která je závazná pro všechna zdravotnická zařízení (státní i nestátní). V § 7 odst. 2 je určen rozsah povinného screeningu provedením jak treponemového, tak i netreponemového testu. Činí se tak v rámci prenatální péče, u základního screeningu novorozenců, při předoperační přípravě, při hospitalizaci apod.⁴ Treponemové metody se samostatně využívají zejména z důvodu své vysoké klinické sensitivity (Elecsys® Syphilis = 100 %) a vysoké klinické specifičnosti (Elecsys® Syphilis = 99,93 %) pro screening dárců krve dle vyhlášky o lidské krvi č. 143/2008 Sb.⁶

Obecné rysy a používané typy netreponemových metod

Netreponemové testy jsou využívány (v kombinaci s treponemovými testy) ke screeningu a zejména k posouzení aktivity onemocnění a úspěšnosti léčby (vzestup, resp. pokles titru protilátek). Jejich obecným rysem je větší množství (2–10 %) falešně pozitivních výsledků (zejména u pacientů s virovými infekcemi, příušnicemi, infekční mononukleózou, planými neštovicemi, ale také u těhotných, uživatelů drog a po očkování) a také výskyt falešně negativních reakcí (v počátku onemocnění před sérokonverzí; u pozdní latentní syfilis představuje až 30 % případů; zonální fenomén u akutní syfilis). Zonální fenomén se může projevit u sér s vysokým titrem specifických a nespecifických protilátek v době akutní syfilis (1–2 %), a znamená tak únik aktivních infekčních onemocnění. V neředěném séru je výsledek vyšetření negativní, se stoupajícím ředěním dochází k rozvoji pozitivní reakce až do endpointu titrace. Vzhledem k uvedeným skutečnostem tedy není vhodné používat netreponemovou metodu jako jediný screeningový test.²  

Pohledem do závěrečné zprávy „Zkoušení způsobilosti v lékařské mikrobiologii“ v rámci externího hodnocení kvality (EHK) zajišťovaného Národní referenční laboratoří (NRL) pro diagnostiku syfilis ve Státním zdravotním ústavu (SZÚ) v Praze, zastoupeném MUDr. Hanou Zákouckou, je možno konstatovat, že v současné době se používají rutinně v ČR tři typy netreponemových metod. Skupiny jsou označeny jako VDRL, RRR/RPR a Imunoturbidimetrie. První dvě skupiny představují manuální metody, zatímco ve skupině Imunoturbidimetrie jsou v současné době zastoupeny dvě automatizované metody stanovení netreponemových protilátek, a sice první generace RPR metody Mediace® aplikovatelná na analyzátory Modular P a nově také druhá generace metody Mediace® RPR 2 určená pro provoz na systémech cobas c 501/c 502.⁴

1. VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) mikrotest – mikroskopický netreponemový test vhodný k vyšetření séra i likvoru. Má všechny přednosti i nedostatky své skupiny, včetně výskytu zonálního fenoménu.
2. RPR (Rapid Plasma Reagin) test – obdoba VDRL mikrotestu s makroskopicky vizualizovanou reakcí (karbonové částice, pigmenty). Komerčně dostupné metodiky obvykle nevyžadují inaktivaci séra (na rozdíl od VDRL).²
3. Imunoturbidimetrie – automatizovaná imunoturbidimetrická stanovení na latexových částicích s fotometrickým vyhodnocením (Mediace® RPR na Roche Modular P, Mediace® RPR 2 pro Roche cobas c 501 a cobas c 502).

Výhody stanovení Mediace® RPR 2 pro rutinní praxi

Mediace® RPR 2 je plně automatizované kvantitativní imunoturbidimetrické stanovení, které je možno použít na modulech c 501/c 502 systémů řady cobas® 6000 a cobas® 8000. Následující tabulka 1 a obrázek 1 ukazují vlastnosti metody a výhody oproti manuálním metodám. 

V příbalovém letáku soupravy je také uvedena hodnota klinické senzitivity pro 187 pozitivně konfirmovaných pacientů ve všech stadiích infekce, a sice 99,5 %. Stejné úrovně bylo dosaženo pro klinickou specifičnost u 2 639 negativních vzorků.³

Praktické zkušenosti s metodou Mediace® RPR 2 na analyzátoru cobas c 501

Hned po uvedení této metody v ČR v říjnu loňského roku jsme po dohodě s firmou Roche zahájili testování jejích vlastností. Cílem tohoto testování bylo zejména prověřit robustnost metody v rutinních podmínkách a také se více seznámit se specifiky tohoto stanovení v rámci testování vzorků z klinické praxe a z cyklu EHK zajišťovaném NRL pro diagnostiku syfilis. 

1) Ověřování robustnosti metody v podmínkách rutinního laboratorního provozu 
V rámci ověřování robustnosti jsme sledovali kalibrační a reagenční stabilitu soupravy Mediace® RPR 2 (250 testů) a také její nároky na nutné manuální intervence laboratorního personálu. Soupravu jsme založili na palubu analyzátoru c 501 dne 27. 10. 2015 bez jakékoli předpřípravy a provedli kalibraci pomocí 5 hladin Roche kalibrátoru, která byla následně ověřena stanovením negativní a pozitivní dedikované kontroly Roche. Kalibrace je platná po celou dobu používání této šarže reagencie po splnění předepsaných kritérií. Souprava byla nepřetržitě ponechána na palubě analyzátoru c 501 při teplotě 4–8 °C a každý pracovní den jsme stanovovali obě hladiny kontroly kvality po dobu 4 týdnů. Výsledky kontroly kvality na obou hladinách zůstaly po celou dobu v deklarovaném rozmezí, takže jsme nemuseli provádět rekalibraci. Pozitivní kontrola navíc zaznamenala u 19 měření velmi dobrou úroveň preciznosti o CV = 3,43 %, což dokladuje obrázek 2. 

Následně jsme zahájili testování vzorků z klinické praxe, dodaných našimi spolupracujícími laboratořemi, a také vzorků EHK, přičemž souprava zůstala po celou dobu založena na palubě. Před stanovením těchto vzorků byla vždy prováděna plná dvouhladinová kontrola kvality. Soupravu jsme spotřebovali pro tyto účely koncem února a za celou dobu jejího čtyřměsíčního používání nebylo nutné provádět rekalibraci, protože kontroly zůstaly v deklarovaném rozmezí. Stanovení EHK byla vždy prováděna v duplikátu, přičemž nebyly zaznamenány žádné diskrepance. Rovněž si toto stanovení nevyžádalo žádné manuální zásahy pracovníků laboratoře. 

2) Testování vzorků z klinické praxe  
Díky laskavosti spolupracujících laboratoří Imalab, s.r.o., a Oddělení klinické mikrobiologie (OKM) Kroměřížské nemocnice, a.s., nám bylo umožněno provést porovnání stanovení naší metodou Mediace® RPR 2 s výsledky vzorků z klinické praxe těchto pracovišť. OKM Kroměřížské nemocnice, a.s., využívá pro tyto účely netreponemovou metodu LTA Syfilide RPR, zatímco privátní laboratoř Imalab, s.r.o., měří rutinní vzorky pomocí metody Omega RPR. Vzhledem k tomu, že stanovení netreponemových protilátek je v rutinní praxi vždy doprovázeno treponemovými metodami měření, vzorky byly testovány i těmito metodami, konkrétně automatizovaným testem Elecsys® Syphilis v případě LAB KM s.r.o. a Imalab, s.r.o., a manuální metodou LTA Syfilide TPLA v OKM Kroměřížské nemocnice, a.s. V rámci stanovení 42 rutinních vzorků z mikrobiologické praxe Oddělení klinické mikrobiologie Kroměřížské nemocnice, a.s., jsme v daném období nenarazili na žádný reaktivní vzorek, nicméně u všech negativních vzorků byla demonstrována jasná shoda u všech typů metod. 

Tabulka 2 nám předkládá výsledky porovnání manuální metody Omega RPR s naší metodou u klinických vzorků ze soukromé laboratoře Imalab, s.r.o. Stanovení treponemových protilátek se provádí v obou laboratořích metodou Elecsys® Syphilis, a proto zde uvádíme výsledky COI získané na obou pracovištích touto metodou jen u reaktivních vzorků. V tomto souboru je menší počet porovnávaných vzorků, nicméně u 3 vzorků (č. 17, 21 a 22) byly pozorovány 3 běžné situace, které se objevují v klinické praxi. Dále je potřeba doplnit, že všechny 3 vzorky byly následně potvrzeny NRL pro diagnostiku syfilis jako pozitivní. Rozdílné hodnocení u vzorků č. 17 a 21 demonstruje vyšší klinickou senzitivitu metody Elecsys® Syphilis a potvrzuje možný výskyt falešných negativit u netreponemových metod, zejména v časné a latentní fázi infekce. 

3) Testování vzorků z cyklu EHK č. 876 NRL pro diagnostiku syfilis 
Za účelem získání dalších zkušeností zejména se stanovováním slabě pozitivních sér jsme využili možnost objednat 5 vzorků EHK v rámci Programu zkoušení způsobilosti č. 876, pořádaném NRL pro diagnostiku syfilis, SZÚ Praha. Tohoto cyklu se v roce 2015 zúčastnilo celkem 172 pracovišť, z toho 53 laboratoří transfuzní služby. V zaslané sérii 5 vzorků bylo zastoupeno 1 negativní sérum a 4 pozitivní séra s různou hladinou specifických a nespecifických protilátek. Bylo zde zařazeno i sérum s vysokým titrem treponemových i netreponemových protilátek odpovídající akutní syfilis (vzorek A), 2 identická séra se středním titrem netreponemových protilátek pro zhodnocení shody výsledků (vzorky B a C) a také sérum s velmi nízkou hladinou netreponemových i treponemových protilátek reprezentující pacienta se starým latentním onemocněním nebo naopak počínající sérokonverzi krátce po kontaktu s infekcí (vzorek D), kde u obou případů je protilátková odpověď minimální.⁴  
Tabulka 3 shrnuje výsledky dosažené pomocí treponemového testu Elecsys® Syphilis na systému cobas® 6000 (modul cobas e 601) a netreponemové metody Mediace® RPR 2 na modulu cobas c 501 Serum Work Area (SWA) systému cobas® 6000. 

Zatímco u imunochemického stanovení treponemových protilátek pomocí technologie elektrochemiluminiscence byla dosažena 100% shoda výsledků získaných metodou Elecsys® Syphilis s výsledky a hodnocením NRL, u netreponemové metody Mediace® RPR 2 jsme zaznamenali jednu neshodu s výsledky a hodnocením NRL u vzorku D s velmi nízkou hladinou protilátek odpovídající počínající sérokonverzi nebo latentnímu onemocnění. Na základě výsledků ostatních účastníků cyklu EHK č. 876 se u tohoto vzorku ukázalo, že i ostatní typy netreponemových metod u tohoto vzorku selhaly (celkem 53 ze 118 laboratoří). Potvrzuje to deklarovanou obecně sníženou klinickou senzitivitu netreponemových metod pro záchyt protilátek v těchto fázích infekce Treponema pallidum. Podskupina treponemových metod zastoupená chemiluminiscenčními a elektrochemiluminiscenčními metodami zachytila pozitivitu vzorku D bez výjimky. Hodnocení úspěšnosti metod stanovení syfilis v tomto typu cyklu EHK se provádí v rámci skupiny účastníků používajících totožný typ metody. Podíváme-li se také na opakované kvantifikace u shodných vzorků B a C metodou Mediace® RPR 2, je zde patrná velmi dobrá preciznost kvantitativního stanovení, což jej předurčuje ke spolehlivému monitoringu úspěšnosti terapie či určení progrese onemocnění syfilis.

Závěr

Závěrem je možné konstatovat, že metoda Mediace® RPR 2 představuje bezpečnou, rychlou, komfortní a nákladově efektivní volbu pro laboratorní diagnostiku syfilis. Toto tvrzení dále podtrhují nadstandardní vlastnosti treponemového testu Elecsys® Syphilis, ověřené multicentrickým lokálním testováním a zkušenostmi z rutinního vyšetřování, a také možnost vyšetření obou povinných testů – netreponemové + treponemové metody na jednom SWA systému cobas® 6000 nebo cobas® 8000 z jedné zkumavky.⁵