Rejekce transplantovaného štěpu představuje jeden z hlavních problémů v transplantologii. Ke značnému snížení pravděpodobnosti odmítnutí orgánu slouží podávání imunosupresiv.
Úvod
Cyklosporin A (CSA) a takrolimus (TCL) patří mezi léky potlačující reakce imunitního systému na nově transplantovaný orgán. Velkou roli hrají samotné rozsahy dávek a interindividuální variabilita farmakokinetických parametrů 1,2,3. Dávky těchto léků jsou v zahajovací a udržovací fázi léčby voleny tak, aby minimalizovaly nežádoucí vedlejší účinky a zajistily odpovídající potlačení imunitní reakce 4. Aby bylo dosaženo co nejlepších léčebných výsledků, je u pacientů prováděno pravidelné terapeutické monitorování hladin těchto léků; ve FN Plzeň je k měření hladin imunosupresiv rutinně využíván systém Abbott ARCHITECT® i2000SR, pracující na principu chemiluminiscenční imunoanalýzy (CMIA). Cílem práce bylo srovnat výsledky získané na tomto systému s výsledky získanými nově nabízenými soupravami pro stanovení CSA a TCL firmy Roche, které pracují na principu elektrochemiluminiscenční imunoanalýzy (ECLIA).
Experimentální část
Celkový počet vzorků pacientů činil 362. Některé naměřené hladiny CSA nebylo možné k hodnocení použít, neboť diagnózou u těchto pacientů nebyla pouze transplantace (imunosuprese): ve skupině se objevovali pacienti s autoimunitními nemocemi, pacienti z chirurgických, očních oddělení či klinické farmakologie. Ti byli pro další porovnávání ze souboru pro menší počet vyloučeni a byli ponecháni pouze nemocní po transplantaci ledviny a kostní dřeně, léčení na Hematoonkologickém oddělení (HOO) a v Transplantační nefrologické ambulanci I. interní kliniky FN v Plzni.
V první části srovnávání bylo použito celkem 284 vzorků nesrážlivé krve, která byla odebrána do zkumavky s K3EDTA. Bylo použito 169 vzorků ke stanovení CSA a 115 vzorků ke stanovení TCL. Nutná byla předúprava vzorků, a to jak v případě systému Abbott, tak v případě systému Roche při stanovení obou analytů. V druhé části bylo zpracováno 78 vzorků pouze ke stanovení hladin CSA. Příprava vzorků k analýze je shrnuta v tabulce 1.
Supernatanty obsahující CSA a TCL byly dále testovány na obou systémech za použití souprav ARCHITECT Cyclosporine, ARCHITECT Tacrolimus Reagent Kit a Elecsys Cyclosporine, Elecsys Tacrolimus. Po celou dobu testování byly sledovány analytické vlastnosti jednotlivých metod. Za tímto účelem se pravidelně prováděly analýzy kontrolního materiálu příslušných firem, kdy se na počátku u obou metod měřily všechny tři hladiny kontrol každý den, později se jednotlivé kontroly střídaly tak, aby byla denně testována minimálně jedna kontrolní hladina. Hladina 1 byla měřena patnáctkrát, hladina 2 čtrnáctkrát a hladina 3 dvanáctkrát. Získané hodnoty opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti jsou uvedeny v tabulkách 2 a 3.
Metodika
Ke stanovení imunosupresiv na systému ARCHITECT® od společnosti Abbott je využívána chemiluminiscenční imunoanalýza (CMIA). Analyt ze vzorku soutěží s CSA či TCL, který je značený akridinovým esterem, o vazbu na monoklonální myší protilátku proti CSA (TCL), která je vázána na paramagnetické mikročástice. Vzniklé komplexy antigen-protilátka se po inkubaci separují magneticky. V alkalickém prostředí dochází působením H2O2 k rozpadu akridinového esteru a vzniká chemiluminiscenční signál, který je detekován. Mezi množstvím CSA (TCL) ve vzorku od pacienta a množstvím relativních světelných jednotek (RLU) detekovaných optickým systémem existuje nepřímá úměra.
Analyzátor využívá ke stanovení vlastní reagencie soupravy ARCHITECT Cyclosporin a ARCHITECT Tacrolimus Reagent Kit, připravené k okamžitému použití. Kalibrační roztoky jsou dodávány v kapalné podobě – ARCHITECT Cyclosporine a Tacrolimus Calibrators, připravené k okamžitému použití. Kontrolní materiál Technopath Control Multichem WBT je dodáván zmrazený, po rozmrazení je možné ho uchovávat v lednici po dobu deseti dnů. Dále je třeba Whole Blood Precipitation Reagent a Whole Blood Solubilization Reagent.
V případě systému cobas e 602 od společnosti Roche se CSA (TCL) stanovuje také kompetitivní imunoanalýzou, která využívá elektrochemiluminiscenční technologii (ECLIA). Imunosupresiva ze vzorku soutěží s CSA (TCL) značeným rutheniovým komplexem o vazbu na monoklonální protilátku proti CSA (TCL), která je vázaná na mikročástice potažené streptavidinem. V případě stanovení CSA se jedná o myší monoklonální protilátku a v případě TCL o ovčí protilátku. Vzniklé komplexy antigen-protilátka se po inkubaci separují magneticky v měřicí cele. Na povrchu elektrody jsou mikročástice zachyceny magnetickým polem. Pomocí roztoku ProCell, který je rovněž substrátem reakce, se odmyjí nenavázané složky z měřicí cely. Po zavedení napětí na pracovní elektrodu dojde k následné chemiluminiscenční emisi fotonů, která je detekována fotonásobičem. Zde platí přímá úměra mezi intenzitou signálu a koncentrací analytu ve vzorku.
Analyzátor cobas e 602 využívá ke stanovení obou imunosupresiv soupravy Elecsys® Cyclosporine a Elecsys® Tacrolimus, které jsou připravené k okamžitému použití. Zvlášť je dodávaný kalibrační a kontrolní materiál (Cyclosporine CalSet, Tacrolimus CalSet a PreciControl ISD) vyžadující předúpravu rozpuštěním v 1,00 ml destilované vody. Dále se užívá precipitační činidlo Elecsys® ISD Sample Pretreatment, které je jediné a zároveň společné pro předúpravu vzorku ke stanovení jak CSA, tak TCL, případně dalších imunosupresiv (Sirolimus, Everolimus). Doplňující třetí stanovení vzorků s hladinami ARCHITECT CSA >= 250 µg/l bylo provedeno na systému Waters® Acquity UPLC® systém metodou UHPLC-MS/MS 5.
Výsledky
Výsledky porovnání obou metod prezentujeme formou komentovaných grafů (Passing-Bablokova regrese a Bland-Altmanovy grafy). Hodnocení výsledků na základě terapeutických rozmezí jednotlivých klinik je prezentováno formou tabulek. Shoda v hladinách do 200 µg/l je dobrá, >= 250 µg/l jsou patrné značné rozdíly mezi jednotlivými metodami [n = 169; r = 0,9376; y = 14,45 (95% CI = 6,81 až 20,34) + 0,86 x (95% CI = 0,82 až 0,91)]. (Obr. 1)
Hodnoty naměřené platformou Abbott jsou vyšší průměrně o 19,5 µg/l, ve vyšších hodnotách se rozdíl zvyšuje. (Obr. 2)
Průměrný rozdíl vysokých hladin CSA mezi metodami CMIA (Abbott) a ECLIA (Roche) je 104,1 µg/l [n = 78; r = 0,8820; y = 59,90 (95% CI = 17,58 až 99,50) + 1,15 x (95% CI = 0,99 až 1,34)]. Nad 2 SD leží 2,6 % výsledků, naopak pod 2 SD leží 1,3 % výsledků. (Obr. 3)
Srovnání vysokých hladin CSA metodami CMIA (Abbott) a UHPLC-MS/MS (Waters) prokázalo průměrný rozdíl hladin CSA mezi oběma metodami 80,9 µg/l [n = 78; r = 0,8824; y = 68,73 (95% CI = 29,12 až 101,90) + 1,03 x (95% CI = 0,88 až 1,20)]. Nad 2 SD leží 3,8 % výsledků, pod 2 SD leží 1,3 % výsledků. (Obr. 4)
Vysoké hladiny CSA naměřené metodou UHPLC-MS/MS (Waters) a ECLIA (Roche) se průměrně liší o 23,3 µg/l [n = 78; r = 0,9195; y = -8,09 (95% CI = -36,47 až 22,87) + 1,13 x (95% CI = 1,01 až 1,28)]. Nad 2 SD leží 3,8 % výsledků, pod 2 SD leží 1,3 % výsledků. (Obr. 5)
Metody CMIA (Abbott) a ECLIA (Roche) jsou zde v dobré vzájemné shodě [n = 115; r = 0,9218; y = -0,30 (95% CI = -0,63 až 0,16) + 1,00 x (0,93 až 1,05)]. (Obr. 6)
Průměrný rozdíl hladin TCL mezi oběma metodami je 0,6 µg/l. (Obr. 7)
Pro každé oddělení je rozhodující jiné terapeutické rozmezí. Na základě toho byli pacienti rozděleni do jednotlivých skupin. Na oddělení HOO je terapeutická šíře CSA 150–300 µg/l, jak ukazuje tabulka 5. Do hodnoty 200 µg/l jsou obě metody téměř shodné. Na diagonále, tedy vždy v totožných RI, je vidět, že celkový rozdíl obou metod je malý. Přesto se 22,73 % výsledků neshoduje. Bez povšimnutí nemohou zůstat ani hodnoty ležící v krajních intervalech, kdy ve čtyřech případech hodnoty měřené na analyzátoru cobas e 602 spadly do vyššího intervalu než tytéž vzorky stanovené na přístroji ARCHITECT®. Naopak 26 vzorků poskytlo v případě cobas® nižší hodnoty než u metody CMIA (Abbott). Toto potvrzuje fakt, že analyzátor cobas® má tendenci nižších výsledků. Hodnoty vychýlené mimo RI v tomto případě nemusí znamenat chybu měření či nesprávně zavedenou metodu. Pravděpodobnou příčinou je zde cílené udržování pacientů po transplantaci právě pod nebo nad terapeutickou hladinou.
Obr. 2: Porovnání naměřených hladin CSA Bland-Altmanovými grafy
Obr. 3: Porovnání naměřených hladin CSA >= 250 µg/l Bland-Altmanovými grafy
Obr. 5: Porovnání naměřených hladin CSA >= 250 µg/l Bland-Altmanovými grafy
Obr. 7: Porovnání naměřených hladin TCL Bland-Altmanovými grafy
Větší korespondence je patrná u vzorků z transplantační nefrologické ambulance I. IK, jak je vidět v tabulce 6. Důvodem může být i nižší koncentrace CSA v těchto vzorcích, kde je mezi oběma metodami větší shoda. Hodnocení TCL bylo v rámci tohoto porovnávání omezeno pouze na transplantační nefrologickou ambulanci
I. IK, kde je využíváno terapeutické rozmezí 10–15 µg/l. Tabulka 7 zachycuje shodu v 92,92 % případů. Většina měření je shodná v intervalu pod 10 µg/l. Nenastal zde případ toho, že by výsledky ležely ve vzdálenosti více než jednoho intervalu, stejně jako tomu bylo u porovnávaných hladin CSA z této ambulance.
Diskuse
Cílem této práce není posuzovat větší vhodnost toho kterého systému, ale srovnat měření pro nás dostupných metod.
Po vyhodnocení celkového souboru naměřených hodnot CSA na obou systémech je na první pohled patrné (obr. 1, 2), že hodnoty CSA naměřené metodou ECLIA Roche Diagnostics jsou obecně nižší, než hodnoty poskytnuté metodou CMIA ARCHITECT®, Abbott. Při bližším pohledu je vidět, že v intervalu od 0 do 250 µg/l jsou výsledky srovnatelné, větší rozdíl je patrný až u vyšších koncentrací.
Srovnání hladin CSA v koncentracích >= 250 µg/l potvrdilo fakt vyplývající již z předchozího hodnocení, tj. že metoda CMIA (Abbott) poskytuje statisticky významně vyšší hodnoty (obr. 3), kdy byl průměrný rozdíl mezi hodnotami 104,1 µg/l (37,6 %). Námi naměřené a porovnané hodnoty hladin CSA jsou shodné s hodnocením uvedeným ve studii multicentrického analytického hodnocení srovnávající hladiny CSA mimo jiné metodou CMIA (Abbott) a ECLIA (Roche), ECLIA (Roche) a UHPLC-MS/MS (Waters) 6. Opomeneme-li rozdíl ve velikosti souboru, který je zde irelevantní, můžeme pozorovat obdobné výsledky. Příkladem může být průměrný rozdíl hodnot CSA naměřený metodami CMIA (Abbot) a ECLIA (Roche), který u hodnot nad 200 µg/l, uvedených v publikaci, činí 24,4 %.
Rovnoměrné rozložení hodnot >= 250 µg/l poskytlo srovnání ECLIA (Roche) a UHPLC-MS/MS (Waters) (obr. 5). UHPLC-MS/MS (Waters) je díky své citlivosti a specifičnosti všeobecně považována za zlatý standard. Její využití je ale v rutinních provozech omezeno a využívány jsou spíše právě imunoanalytické metody. V rámci této práce bylo možné námi naměřené výsledky porovnat s výsledky získanými metodou UHPLC-MS/MS (Waters) díky spolupráci s Ústavem laboratorní diagnostiky FN Ostrava. Výsledky našeho srovnání metodami ECLIA (Roche) a UHPLC-MS/MS (Waters) vykazují dobrou shodu a jsou mírně nadhodnocovány spíše v případě metody UHPLC/MS-MS (Waters). Tento fakt však není shodný s výsledky uváděnými v publikaci z roku 2014 6, kde metoda ECLIA (Roche) poskytuje výsledky vyšší oproti metodě UHPLC/MS-MS (Waters). Je však nutné uvést, že v publikaci srovnávali tyto metody v celém rozsahu měření a ne pouze hodnoty >= 250 µg/l.
Porovnání hladin TCL na zmíněných systémech poskytlo obdobné výsledky jako v případě prvního imunosupresiva. Tuto skutečnost zachycuje graf (obr. 6, 7), na kterém je však zřejmé, že rozdíly v měření jsou opravdu minimální a metody jsou zde ve větší vzájemné shodě. Experimentem prokázaný průměrný rozdíl 8,4 % je možné porovnat s hodnotou 10,5 % uvedenou v literatuře 7.
Závěr
Výsledky stanovení CSA metodou CMIA (Abbott) a ECLIA (Roche) byly statisticky odlišné, a to zejména v hodnotách >= 250 µg/l. Nejlepší shodu se zlatým standardem UHPLC-MS/MS (Waters) prokázala metoda ECLIA (Roche) s nejmenším průměrným rozdílem 23,3 µg/l a korelačním koeficientem 0,9195. V případě TCL jsou metody v dobré vzájemné shodě. Velkým přínosem firmy Roche je také jednokroková předúprava vzorku pomocí univerzálního činidla pro všechna imunosupresiva a stabilní dvoubodová kalibrace.