Novým vlastníkem obchodních práv k technologii polymerázové řetězové reakce, chráněné 17 patenty, nebyl jen tak někdo. Společnost F. Hoffmann-La Roche s ústředním sídlem ve švýcarské Basileji měla v době akvizice více než devadesátiletou historii s významnými výsledky. 

Po založení v roce 1896 patřila mezi první průmyslové výrobce farmak do té doby výhradně připravovaných magistraliter v jednotlivých lékárnách. V roce 1945 vstoupila akvizicí Pantene Corporation do oblasti kosmetických přípravků, jimž se v Basileji a americkém Nutley věnovalo téměř 4 000 pracovníků. O dvacet let později zřizuje bioelektronické oddělení zaměřené na vývoj a výrobu automatických analyzátorů a akvizicí firmy Dr. R. Maag AG vstupuje do oblasti agrochemikálií. Významně podporuje i základní výzkum, pro nějž zřizuje Roche Institute for Molecular Biology v americkém Nutley ve státě New Jersey, Basel Institute for Immunology ve Švýcarsku a v japonské Kamakuře pak Nippon Research Institute.

K významnému posunu v činnosti společnosti dochází v roce 1968, kdy vstupuje na trh laboratorní diagnostiky. Významným přínosem pro další vývoj laboratorních diagnostických technik a automatických analyzátorů, ale i pro získávání důvěry odborné veřejnosti v nové technologie bylo zřízení sítě servisních laboratoří, které působily jednak jako referenční pro problémové výsledky jiných diagnostických laboratoří, jednak přímo jako diagnostické laboratoře pro klienty z řad nemocnic, praktických a odborných lékařů. To znamenalo změnu v doposud vžitém názoru, že laboratoře mají být součástí oddělení a ambulancí příslušných zdravotnických zařízení, a připravovalo půdu pro budoucí proces koncentrace laboratorních vyšetřovacích metod do velkých provozních celků obsluhovaných velkokapacitními automatickými analyzátory. 

Po reorganizaci na konci deváté dekády minulého století tvořily společnost Roche čtyři divize: Pharmaceuticals, Vitamins and Fine Chemicals, Diagnostics a Flavours and Fragrancies. Produkce farmaceutické divize zahrnovala škálu kvalitních, velmi dobře prodejných léků od antidepresiv přes antibiotika až po cytostatika a interferon alfa, divize Flavours and Fragrancies, jejíž součástí byli i tradiční výrobci francouzských parfémů Givaudan SA a Roure, vyráběla podstatnou část parfémů předních světových značek, jejichž držitelé je pouze rozplňovali do designových flakonů.

Výrobky divize Vitamins and Fine Chemicals jako Supradyn, Bepanthen a řada dalších měly na trhu rovněž výbornou pozici. Také postavení diagnostické divize na trhu zejména biochemických a mikrobiologických diagnostik bylo velmi solidní. Pověst firmy byla sice poněkud pošramocena v roce 1976 kvůli havárii v továrně Industrie Chimiche Meda SA v italském Sevesu, při níž došlo k úniku mraku 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-para-dioxinu (vedlejšího produktu při výrobě trichloropenolu) s přímým dopadem na hustě zalidněnou oblast milánské aglomerace. ICMESA byla totiž dceřinou společností firmy Givaudan SPA, člena skupiny Roche. Při likvidaci havárie společnost Roche aktivně spolupracovala s italskými úřady a na úhradu nákladů na dekontaminaci poskytla v roce 1978 17 milionů USD, v roce 1980 pak na kompenzaci zaplatila italské vládě dalších 114 milionů USD.

Jak jsem již uvedl v minulém čísle, společnost Roche měla významný podíl na rozvoji molekulární biologie. V roce 1980 vstoupila do oblasti genového inženýrství navázáním spolupráce s kalifornskou firmou Genentech (mj. významným konkurentem Cetus Corporation), jejímž výsledkem bylo v roce 1986 uvedení interferonu alfa na trh pod názvem Roferon-A. V roce 1990 se Roche stává majoritním akcionářem Genentechu. Dohoda s Cetus Corporation tedy velmi dobře zapadá do strategického záměru soustředit kapacity pro urychlení vývoje molekulárně biologických technologií jak pro farmacii, tak pro diagnostiku. Další rozvoj PCR je zajištěn společností patřící mezi tři největší farmaceutické výrobce na světě, s téměř 60 000 zaměstnanci, výrobními závody na třech kontinentech a obchodním zastoupením ve 150 zemích světa, která je navíc známa schopností jedněch z nejvyšších investic do výzkumu a vývoje.

Cesta na trh

První soupravou Amplicor připravenou pro trh byl test Amplicor HLA DRB. Vedení společnosti si však plně uvědomovalo potenciál diagnostického využití nehumánního (nebo – jak dnes říkáme – extrahumánního) genomu v diagnostice onemocnění infekční etiologie. Proto byly vybrány další rozpracované testy k urychlenému dokončení. Nepřekvapí, že jedním z nich byl HIV, kde šlo o uzavření v té době tříměsíčního diagnostického okna, což detekce provirové DNA z izolátu lymfocytární frakce plné krve do značné míry umožnila. Třetím připraveným testem byla detekce specifických úseků DNA z plazmidu Chlamydia trachomatis, obtížně kultivovatelné bakterie s intracelulárním reprodukčním cyklem, která působí řadu závažných onemocnění od trachomu po sexuálně přenosné infekce vedoucí ke sterilitě. Na největším potenciálním trhu – USA – čekala však nelehká překážka: schvalovací řízení FDA (Federal Drug Administration).

V první etapě schvalovacího řízení šlo o povolení k výzkumnému použití in vitro testů, aby bylo možné začít provádět evaluační studie. Celý proces FDA je běh na dlouhou trať, obvykle trvající několik let. Výhodou bývá, pokud uchazeč může předložit výsledky evaluačních testů ze zahraničí, na jejichž základě bylo diagnostické využití schváleno tam. Nadnárodní společnosti jako F. Hoffmann-La Roche AG této možnosti pochopitelně využívají. Takže hurá do Evropy!

Začátek devadesátých let byl pro občany bývalých socialistických států včetně tehdejšího Československa v očekávání významných změn. Pocit nově nabyté svobody vedl k obecnému optimismu. Očekávali jsme rychlé zlepšení ve všech oblastech života, pracovní podmínky nevyjímaje. Chtěli jsme mít to, co bylo na západ od našich hranic běžné, také ve zdravotnictví. Podnikavější z nás se v očekávání privatizace pouštěli do aplikace teoretických poznatků získaných z dostupné odborné literatury do rutinní praxe a pokoušeli se o přípravu výroby diagnostických testů. Nebylo to nic nenormálního. Letité období nedostatku devizových prostředků pro dovoz čehokoliv a těžkopádných několikastupňových schvalovacích řízení nám poskytlo dlouhodobý trénink ve vymýšlení alternativních postupů i úpravách pracovních pomůcek a přístrojů tak, aby mohly vést k vytouženému cíli. Na několika pracovištích se kolegové pustili i do vývoje diagnosticky použitelných PCR testů. Další, zejména mladí kolegové, dostali možnost vyrazit na zkušenou formou stáží na zahraničních pracovištích a po návratu se pokoušeli realizovat nabyté zkušenosti. Zpoza padlé železné opony přicházely přísliby pomoci. Tehdejší ředitelé okresních nemocnic v příhraničních okresech dodnes vzpomínají na řadu potřebných, plně funkčních second hand přístrojů, vyřazovaných při periodických inovacích v příhraničních bavorských a rakouských nemocnicích, které místo zániku ve šrotu přispěly k technické modernizaci jejich zdravotnických zařízení.

První dva porevoluční ročníky výstavy Pragomedica byly určitým zklamáním. V roce 1990 se prezentovali většinou u nás již zavedení dodavatelé a ani v roce 1991 nebyla situace o moc lepší. Náš farmaceutický trh byl považován za obsazený a v ostatních oblastech včetně diagnostiky se teprve zjišťovaly možnosti. Tato činnost byla svěřena převážně rakouským zástupcům, ať již filiálkám výrobců, nebo dealerským společnostem. Vzpomínám, jak se v roce 1991 jednou v podvečerních hodinách objevil na našem ústavu ve Studničkově ulici zástupce rakouské firmy Epignost GmbH z Lince. Přišel nám nabídnout soupravy kalifornské firmy GenProbe Inc. pro molekulárně genetický průkaz C. trachomatis pomocí značených hybridizačních sond. Podmínky byly přátelské, tehdejší rozpočet ústavu to také dovoloval, dohodli jsme se poměrně rychle. Při pozdějším „přitahování šroubů“ jsme měli naštěstí již i jiné finanční zdroje.

Po vyčlenění národního podniku SPOFA z rezortu zdravotnictví, jeho začlenění pod průmysl a rozdělení na jednotlivé závody v rámci ohlášené privatizace se výrazně zvýšil zájem zahraničních firem o československý trh. Stalo se tak i díky odstranění dotací na výrobu léků, čímž se podstatně zvýšila konkurenceschopnost přípravků z dovozu. Nejenže se v roce 1992 významně zvedla účast vystavovatelů na Pragomedice, ale vznikla i řada nových zastoupení významných společností v ČSFR. Jednou z těchto společností je Roche s.r.o. Diagnostická divize však zpočátku v Praze zastoupena nebyla. Reprezentantem pro Československo byl Ing. Ján Neubauer, CSc., a distributorem zboží pak firma Intes Poprad s.r.o. Teritoriálně příslušná pro ČSFR pak byla diagnostická divize F. Hoffmann-La Roche GmbH ve Vídni, která měla působnost pro celou střední a východní Evropu.

Vedení Roche si bylo vědomo, že úspěch PCR na diagnostickém trhu nebude zadarmo a vyžádá si nejen značné investice, ale i soustředěné úsilí celé společnosti minimálně po dobu 5 až 10 let. Přistoupilo proto k realizaci významných změn uvnitř diagnostické divize – všechny filiálky RD zřizují novou pozici manažera pro PCR. V RD Vídeň se jím stal MUDr. Pavel Henčl. V Kaiseraugstu se formuje tým odborníků pro vědeckou podporu PCR, z něhož se později stává PCR Academy. Posilují se týmy v oblasti výzkumu a vývoje. V polovině roku 1992 firma prodává svoji výrobu mikrobiologických diagnostik společnosti Becton and Dickinson Inc. a v oblasti přímé diagnostiky infekčních onemocnění se plně soustředí na rozvoj technologie PCR. Pořádají se první konference o PCR a testech Amplicor.

Amplicor přichází do Československa

Skokový vzestup cen potravin v červenci 1990 byl začátkem neúplné inflační spirály, kdy růst cen nebyl až do roku 1996 následován růstem mezd ve státním sektoru, a přiváděl velké množství zvláště mladých akademiků do složité ekonomické situace, kterou řešili hledáním dalších výdělečných aktivit. Naštěstí nabídka míst firemních zástupců byla od roku 1992 poměrně rozsáhlá. Na druhé straně firmy měly výběr ze vzdělaných i poměrně zkušených lidských zdrojů, navíc naučených loajalitě. Nastal tedy odliv pracovníků z akademické sféry.  
Já jsem v té době sice z fakulty neodešel, živilo mne však několik vedlejších aktivit. Díky svému spolužákovi z gymnázia MUDr. Karlu Holubovi jsem se ocitl v redakci týdeníku STATIM, vydávaném jako konkurence Zdravotnických novin. Omlouvám se váženým čtenářům za osobní pohled, avšak moje následná několikaletá žurnalistická praxe sehrála párkrát důležitou roli také v rozvoji PCR v ČR. Pozice zástupce šéfredaktora a odborného redaktora mi umožňovala udržovat kontakt s firemními reprezentanty, účastnit se tiskových konferencí a názorových fór, besed s úředníky MZ, řediteli zdravotních pojišťoven, představiteli profesních komor apod.
   
Koncem června 1992 mne dr. Henčl pozval na zákaznické sympózium Roche do Staré Lesné v Tatrách, kde se odehrálo první představení technologie Amplicor v Československu. Tím byl pověřen dr. J. Werner Zolg. Na letiště v Popradu přicestoval poněkud dobrodružným způsobem, s uvítacím výborem se minul, nicméně do cíle dorazil. Svou prezentaci zahájil v americkém stylu větou: „Dámy a pánové, bakteriologická klička od dnešního dne patří do muzea!“, čímž nejen mne poněkud zvedl ze židle. Diskuse po přednášce byla ostrá, argumentačně bohatá a vcelku lze konstatovat, že přednášející publikum moc nepřesvědčil. Laboratoří vyšetřujících rutinně chlamydie nebo HIV v té době v ČSFR nebylo mnoho. Večer byla na programu slavnostní večeře, na kterou jsem se poněkud opozdil. Když jsem vstoupil do sálu, zbývala již jen dvě volná místa u stolu organizátorů. Dr. Zolg se opozdil ještě více, takže usedl vedle mne. Počáteční mlčení prolomil Werner Zolg větou: „Četl jsem o té vaší Strasse E55 (trasa Dubí u Teplic – Cínovec byla v té době doslova lemována prostitutkami). To je strašné riziko! Vy musíte jít do parlamentu! Vy musíte získat peníze, abyste to včas podchytili!“ Už jsem se viděl, jak odcházím z Federálního shromáždění, řešícího tehdy rozdělení republiky, po úspěšném lobbingu s pytlem peněz na diagnostiku AIDS… Velmi úsměvné. Nicméně diskuse, tentokrát v přátelském duchu, byla zahájena a úspěšně pokračovala celý večer. Vínko se pilo, cimbálovka hrála, čas utíkal, účastníci postupně odcházeli, až jsme ve 3 hodiny ráno zbyli u stolu čtyři: Werner Zolg, Ján Neubauer, Pavel Henčl a já. O půl hodiny později jsme si slíbili, že všichni uděláme vše pro to, abychom technologii Amplicor co nejdříve dostali do republiky. Cestou domů a v následujících týdnech běžného pracovního shonu se mi možnost dodržení daného slibu už moc reálná nezdála. Naštěstí jsem tehdy nevěděl, jak moc se mýlím. 

Silvestrovská noc roku 1992 vytvořila hraniční čáru. Nový rok nás uvítal ve 2 samostatných státech. Společná měna vydržela jen 6 týdnů, pak se v Česku kolkovaly bankovky, na Slovensku se koruna vůči české kurzově propadla o 20 %. Urychleně se budovaly hraniční přechody. Novinky nás čekaly téměř všude. Ze státních rozpočtových organizací se staly příspěvkové. Vznikaly zdravotní pojišťovny. K financování výzkumu vznikaly grantové agentury. V březnu byla publikována první výzva k podávání projektů. Můj tehdejší šéf, doc. MUDr. Marek Bednář, CSc., mne pověřil přípravou jednoho z projektů – týkal se diagnostiky pohlavně přenosných infekcí. Kolegové připravující jiné projekty se drželi při zemi a žádali o podporu v řádu deseti, maximálně statisíců korun. Já jsem se rozmáchl poněkud více. Rozpočet projektu činil dva a půl milionu. Říkali mi, že jsem blázen pohybující se mimo realitu. Pochybnosti měl i doc. Bednář, hlavní řešitel tohoto projektu, nicméně projekt byl podán. Potvrdilo se, že štěstí přeje odvážným. V posledním srpnovém týdnu jsem byl náhle volán do přednostenské pracovny, kde jsem se dozvěděl, že projekt byl přijat a že jsme obdrželi grantovou dotaci 1 750 000 Kč, kterou je třeba vyčerpat do listopadu. Požádal jsem o 2 dny dovolené a odjel do Vídně. Vrátil jsem se s cenovou nabídkou, následovala objednávka a promptní dodávka. Část třetího zářijového týdne jsem strávil na školení v Kaiseraugstu u Basileje, po návratu do Prahy jsem technologii zprovoznil. V říjnu, na dalším zákaznickém sympóziu Roche ve Staré Lesné, jsme publikovali první výsledky. Daný slib byl splněn.

První zkušenosti s testy Amplicor

Jak jsem se již zmínil v minulém čísle LA CS (4/17), jedním z problémů před uvedením testů Amplicor na trh byla možná kontaminace dříve syntetizovanými amplikony z prostředí laboratoře. I přes patentované řešení AmpErase® doporučoval výrobce provádět PCR ve 3 oddělených místnostech s jednosměrným pohybem personálu tak, aby se minimalizovala možnost zavlečení amplikonů do prostoru manipulace se vzorky. V ústavu jsme měli k dispozici bývalou laboratoř tkáňových kultur se třemi prosklenými přepážkami oddělenými pracovními boxy a chodbičkou s digestoří. Digestoř jsme posléze zaměnili za pracovní skříň s laminárním prouděním tř. II a biohazard box.

Příprava vzorků u testů Amplicor se prováděla ručně pomocí souprav Amplicor Preparation Kit. Ty byly zpočátku specifické pro každý test (HIV-1 plná krev, chlamydie výtěrový tampon v odběrovém a transportním médiu). U HIV bylo třeba nejprve lyzovat erytrocyty a promýváním s následnou centrifugací připravit lymfocytární frakci, u chlamydií se vytřepával dakronový výtěrový tampon do odběrového a transportního média. Další fáze – cytolýza pro uvolnění DNA – již byla obdobná, po inkubaci v DriBlocku a centrifugaci byl odebírán supernatant obsahující uvolněnou DNA. Potřebným přístrojovým vybavením pro tuto fázi byla mikrocentrifuga Eppendorf 5435 s úhlovým rotorem pro 2ml zkumavky se šroubovacími víčky. Pro inkubaci byl ideální kontaktní inkubátor DriBlock, šlo však použít i malou vodní lázeň, zpravidla po mírné technické úpravě (vertexová regulace teploty). Pro odstranění supernatantu při promývání jsme jako dědictví po buněčných kulturách měli k dispozici odsávání pomocí vývěvy. Do této fáze spadala také příprava pozitivní a negativní kontroly – připravovaly se pracovní roztoky rozpuštěním lyofilizátu v pufru dodávaném v soupravě. Pak se 50 μl kontroly použilo do amplifikační reakce místo vzorku.

V amplifikačním boxu byla jediná nutná investice – termocyklér. Roche Diagnostics System doporučoval Perkin-Elmer TC 9600. Byl to mikroprocesorem řízený programovatelný cyklér s hliníkovým blokem pro 96 dvousetmikrolitrových tenkostěnných amplifikačních mikrozkumavek, jímž jako tepelné médium proudil olej. Amplifikační blok měl vyhřívané víko proti kondenzaci na víčkách mikrozkumavek. Jedinou nevýhodou ve srovnání s moderními cykléry pracujícími na odlišném principu byly poměrně dlouhé „ramp temperatures“ (intervaly změny teplot v rámci cyklu: 2 °C/s). Třicet cyklů amplifikace trvalo téměř dvě a půl hodiny. Jinak šlo o výrobek vysoké kvality, sloužil nám v rutinní diagnostické praxi s minimální údržbou a bez poruch téměř 11 let, ještě dnes je plně funkční. Po ukončení amplifikace bylo nutno ručně provést denaturaci amplikonů 50 mikrolitry NaOH do každé mikrozkumavky. Zahřívaná víčka bez kondenzátu snižovala riziko tzv. cross-over kontaminace při otevírání zkumavek před denaturací. Všechny potřebné reagencie pro amplifikaci a následnou denaturaci byly k dispozici v Amplicor Amplification Kit. 

V dalším boxu byla umístěna automatická promývačka polystyrénových mikrodestiček ELISA, optický denzitometr na mikrodestičky (microELISA-reader) s filtrem 450 nm a termostat nastavený na 37 °C. Probíhala zde detekce nových amplikonů. Specifická záchytná hybridizační sonda navázaná na povrch jamek mikrodestičky s plochým dnem fixovala nově vzniklé amplikony. Po důkladném promytí byl aplikován streptavidinový konjugát-HRP (s křenovou peroxidázou), který se navázal na biotinylované amplikony. Po dalším důkladném promytí byl přidán substrát TMB (tetrametylbenzidin) s H2O2. Po další inkubaci byla reakce zastavena 20% kyselinou sírovou. Následovalo odečtení reakce v optickém denzitometru. Veškeré reagencie potřebné pro detekci obsahoval Amplicor Detection Kit. 

Testy Amplicor byly uživatelsky přívětivé a robustní. Jak ukázala praxe, úzkostlivé obavy z možné kontaminace nebyly na místě, takže od konceptu tří izolovaných místností se brzy upustilo. Bohatě postačovala Hansenova skříň (Dead Air Box) na přípravu reagencií, biohazard box pro přípravu vzorků a 3 oddělené sady mikropipet s upravenými špičkami s filtrem. Žertem jsem říkával, že díky jejich koncepci lze testy Amplicor provádět všude, kde je k dispozici čisté prostředí, elektrický proud a destilovaná voda – třeba v subsaharské Africe. Tehdy jsem netušil, že v budoucnu budu mít možnost ověřit své tvrzení v praxi. Ale o tom až někdy příště.

Dr. rer. nat. J. Werner Zolg

Německý molekulární biolog narozený 1946 ve Wormsu. Vystudoval mikrobiologii na Technische Hochschule  
v Darmstadtu, doktorát získal na mnichovské univerzitě. Po dvouletém působení ve skotském Edinburghu odchází do USA, kde následující 2 roky pracuje v Naval Medical Research Institute v Bethesdě ve státě Maryland. Následujících 6 let vede oddělení molekulární biologie v Biomedical Research Institute v Rockville (Maryland), kde se věnuje výzkumu malarických plasmodií, vývoji jejich průkazu pomocí techniky PCR  a problematice PCR průkazu HIV. V dubnu 1990 přijal nabídku Roche Diagnostics Division v Kaiseraugstu, kde zodpovídal za vývoj soupravy pro PCR diagnostiku mykobakterií (patentová přihláška z roku 1993 se Sabinou Philippi-Schulz) a současně působil ve skupině PCR Scientific Support pro Evropu. Od roku 2005 se ve výzkumu věnoval převážně onkologické problematice, výsledkem je 24 evropských a US patentů podaných do roku 2011 (kolorektální karcinom, karcinom prsu, revmatoidní artritida). Publikoval i články týkající se strategií vývoje moderních technik laboratorní diagnostiky. 

 

Pro článek byly použity tyto informační zdroje: 

1) www.fundinguniverse.com/companyhistories/f-hoffmann-la-roche-ltd-history 
2) DeMarchi B., Funtowicz S., Rewetz J.: 4 Seveso: A paradoxical classic Disaster. United Nations University 
3) Seveso – 30 years after. A chronology of Events. Roche Group 2006 
4) https:/patentsjustia.com 
5) archiv autora