Tak máme zautomatizovanou PCR amplifikaci a detekci koncového bodu produktu. Bonusem navíc je zvýšená citlivost a opakovatelnost výsledků, což přispělo ke zpřesnění kvantifikačních testů. Přístroje COBAS® Amplicor dodávané zákazníkům pracují spolehlivě, pokud nejsou plně obsazené vystaveny teplotě nad 32 °C. Ale na to již po draze zaplacených vlastních zkušenostech zákazníky upozorňujeme. K usnadnění ovládání byla připravena tabulka čárových kódů pro jednotlivé povely, odkud je možné zadávat program pomocí čtečky, čímž se lze vyhnout nepříliš pohodlnému zapisování prostřednictvím membránových kláves na tělu přístroje. Výrobce slibuje rychlý vývoj ovládacího softwaru pro přenosné počítače (notebooky) AmpliLink® i vývoj automatu pro přípravu vzorků.

Opět sedím v letadle do Curychu a čeká mě třídenní školení v nových aplikacích na PCR Academy v Kaiseraugstu. V úvodní přednášce je potvrzena práce na automatizaci přípravy vzorků. Jednou z podmínek zadání opět je, že jeden test se nesmí prodražit o více než 1 americký dolar. Volné pracoviště vedle mne druhý den obsazuje mladý muž, výrazně se lišící od formálně oblečených a upravených Švýcarů v košili s vázankou a tmavém obleku, pouze v pátek s rozhalenkou. Tento vzhledově připomínal amerického akademika. Jak se ukázalo, dotyčný frekventant kurzu byl konstruktérem nového automatu s pracovním názvem COBAS® AmpliPrep® a do kurzu byl zařazen proto, aby si vlastnoručně osahal procesy přípravy vzorku, které měl nahradit automatem. Skvělý nápad.

Vývoj COBASu® AmpliPrep® byl velmi rychlý, trval pouhých 14 měsíců. Navíc vybraným zákazníkům Roche byla dána možnost tento vývoj sledovat od prvních výkresů až do finální podoby sériové výroby a připomínkovat technická řešení. Když se například potřebná tuhost konstrukce odolávající protipohybům dvou přenosových ramen projevila ve vysoké hmotnosti přístroje, naše připomínka, že jde o hodnoty přesahující nosnost běžného laboratorního stolu, vyústila v konstrukci speciálního podvozku nesoucího navíc zásobníkové kanystry. A tak by se dalo pokračovat o řadě dalších detailů. Nakonec vznikl velmi povedený a do značné míry unikátní stroj, který by však nebyl využitelný bez ovládacího softwaru AMPLILINK®.

První verze softwaru AMPLILINK® je poznamenána stupněm vývoje počítačové techniky v období vzniku. Byla vyvíjena jako varianta k ovládání COBAS® AMPLICOR, který bylo možné také řídit přímo prostřednictvím vlastní klávesnice a čtečky čárových kódů. Reakce přístroje se odečítala na dvouřádkovém displeji nebo tiskla a stroj měl vlastní paměťovou jednotku na 150 amplifikačních kroužků. Vrcholem počítačové techniky byl v té době procesor Pentium® 100 Hz a hodnoty RAM a ROM byly v kB. Přesto již tato softwarová verze umožňovala řízení až 3 přístrojů COBAS® AMPLICOR z jednoho osobního počítače. Třetí vývojová verze softwaru byla již připravena k řízení plně automatizovaných diagnostických testů COBAS® AMPLICOR/AmpliPrep® HIV a HIV Monitor, COBAS® AMPLICOR/AmpliPrepTM HCV a HCV Monitor a COBAS® AMPLICOR/AmpliPrepTM HBV a HBV Monitor. Tím se systém COBAS® AMPLICORTM/AmpliPrepTM stal první plně automatizovanou linkou k provádění kvalitativní i kvantitativní PCR. V této první fázi automatizace zůstával jeden jediný manuální úkon – přenos izolátů z COBAS® AmpliPrep do cyklérů COBAS® AMPLICOR. Ani konkurence nespala. Firma Gen-Probe Inc. vozila po kongresech především v USA, ale i v Evropě, model kompaktního automatického analyzátoru Tigris pro Transcription Mediated Amplification v měřítku 1:1. Přestože herecký výkon předvádějícího byl hodný profesionála (viz obr. 1), v chodu jsme automat spatřili poprvé až po sedmi letech vývoje v roce 2004.

Po téměř rok trvajícím projednávání vydaly příslušné německé soudní orgány v roce 1998 verdikt ve věci akvizice společnosti Boehringer Mannheim, na níž neshledaly nic, co by bylo v rozporu s pravidly hospodářské soutěže. Realizace spojení obou firem de iure mohla začít. Jak jsem již uvedl, Boehringer vlastnil lepší areály a budovy, takže se obvykle Roche stěhovala k Boehringerovi, což se navenek projevovalo i tím, že modrá krychle s nápisem „boehringer mannheim“ byla nahrazována hexagonem Roche. Občas se to neobešlo bez emocí. Byl jsem svědkem slz v očích původních loajálních zaměstnanců Boehringera, když krychle se střechy padala na zem. Jedna etapa života pro ně skončila.

Již v minulém pokračování jsem se zmínil, že akvizicí Boehringera získala fa Roche další technickou platformu pro PCR – LightCycler®. Zde je však delší historie. Koncepce PCR v reálném čase vznikla v Roche Molecular Systems na přelomu let 1990 a 1991 jako takzvaná kinetická PCR s využitím technologie FRET – fluorescence resonance energy transfer, na jejímž základě vznikly sondy TaqMan®. Instrumentálně posloužil cyklér Perkin-Elmer 9600, nad jehož amplifikační komoru byl zkonstruován multikanálový optický snímač pro fluorescenční signál. Takto upravený přístroj byl označen jako Perkin-Elmer 5700. Do sériové výroby se však nikdy nedostal, neboť byl limitován vlastnostmi olejového výměníku tepla, který nedovoluje potřebné rychlé změny teploty. Zkrácení tzv. RAMP temperature přinesly cykléry využívající Peltierova principu, ale nešlo zdaleka o poslední zlepšení. Na scéně se objevuje RapidCycler® firmy Idaho Inc. s revolučním zjednodušením. Výrazně se snižuje objem reakční směsi na 15 μl a 5 μl vzorku – celkem tedy 20 μl. Pro zvýšení vodivosti tepelné energie se plast nahrazuje borosilikátovým sklem. Ohřev obstarává elektrická spirála, teplo se přenáší vzduchem, chlazení je zajištěno nasáváním chladného vzduchu zvenčí, podobně jako u elektrického vysoušeče vlasů. Výhodou – kromě zkrácení RAMP temperature – je i zkrácení celého amplifikačního cyklu a tím celé amplifikace.

Na stejném principu pracuje LightCycler®. V jeho amplifikační komoře je rotor se 32 pozicemi pro amplifikační skleněné kapiláry. Rotor se krokově otáčí tak, aby se dno každé kapiláry zastavilo nad LED emitující UV záření, které excituje fluorofory v kapiláře. Jimi emitované světlo prochází na hranol, odkud se láme na filtry před snímači vlnových délek. LightCycler® verze 1.0 a 1.5 měl čtyři kanály a detekoval světlo vlnových délek 530, 560, 610 a 705 nm, LightCycler® verze 2.0 byl šestikanálový (530, 560, 610, 640, 670 a 705 nm). Začlenění LightCycleru® do portfolia Roche umožnilo vedle rozvoje mikroarrayí na konci tisíciletí významné posílení segmentu dodávajícího materiál vědecko-výzkumným zařízením.

Dlouholetá spolupráce Roche s firmou Affymetrix přinesla konečně ovoce ve formě GenChipu. První komerční test (Cytochrom P450) byl představen v Londýně v červnu 2000 pod obchodním jménem AmpliChip® CYP450 Test.

Co se do výroby nedostalo

Jedním z prvních testů Amplicor, které jsme zaváděli v naší laboratoři na ÚIM 1. LF UK, byla souprava k detekci mykobakterií, za jejíž vývoj zodpovídal J.  Werner Zolg. Vývoj probíhal v několika etapách, přičemž vše směřovalo k přípravě etapovitého testu Amplicor Mycobacterium. Zámysl byl následující: vzhledem k amplifikaci 585 párů bází dlouhého úseku genomu mykobakterií, obsahujícího rozdílné úseky specifické jen pro určitý druh, se přímo nabízela detekce rodově specifické sekvence. K ní sloužila detekční sonda KY 166. Takže v prvním kroku bylo třeba odpovědět na otázky: Jde o mykobakterie? Nejde náhodou o negativní výsledek způsobený inhibitory? Další krok jen u pozitivních: Jde o MTBC? Pokud ne, následuje třetí krok, a to detekce M. avium / M. intracellulare.

U negativních výsledků následuje testování pomocí sond Accuprobe. Díky spolupráci s RNDr. M. Müllerovou z laboratoří Kliniky TRN v Praze-Veleslavíně a později s KlinLab, spol. s r.o., jsme měli dostatek pozitivních vzorků pro evaluaci testů, takže jsme se mohli podílet na evaluačních studiích (výsledky publikované na ESM v Lucernu v červenci 1999 na obr. 5). I přes velmi dobré zkušenosti s detekční sondou KY 166 nejen na našem pracovišti souprava v tomto složení na trh nikdy nepřišla a možnosti dané uspořádáním analyzátoru COBAS® Amplicor zůstaly nevyužity. Hlavním důvodem bylo, že kromě většiny rozvojových zemí mají i dva z významných zákazníků s rozhodujícím podílem na trhu – USA a Francie – kontaminované vodovodní sítě Mycobacterium marinum. V důsledku toho se nepatogenní mykobakterie najdou v orofaryngu prakticky všech občanů, takže zjištění rodové pozitivity nemá diagnostický smysl.

V návaznosti na test Amplicor MTB bylo možné od poloviny poslední dekády minulého století využít i produkt firmy Innogenetics detekující gen rezistence na rifampicin na principu dot blot. Firma Innogenetics měla v té době i další test InnoLiPa, tentokrát navazující na soupravu Amplicor HCV – HCV genotyping. V době omezených terapeutických možností hepatitidy C a výskytu interferon-α rezistentního genotypu viru na našem území měl tento test velký význam. Bohužel, oba výše uvedené testy k dispozici nebyly. Firma Innogenetics získala nového vlastníka, který se nedohodl s držitelem autorských práv k testům. Případ skončil u soudu v Nizozemsku. Ten vydal předběžné opatření spočívající ve stažení předmětů sporu z trhu až do definitivního verdiktu soudu. A soudy, jak vidno nejen u nás, mají na všechno času dost. Testy InnoLiPa se vrátily na trh až v novém tisíciletí a staronový výrobce Innogenetics jim hledal někdejší zákazníky.

Ach, ty soudy…

V úvodu tohoto seriálu jsem zmiňoval soudní spor mezi Cetus Corporation a Amgen Inc. o prioritu výzkumu Interleukinu 2. Podobných sporů je vedeno mnoho a verdikty bývají velmi různé. Sumárně lze konstatovat, že jde o velký byznys pro renomované advokátní kanceláře, a ty se snaží, neboť každý vyhraný spor znamená šanci na výhodnou smlouvu o zastupování dalších klientů. Mnohdy jde i o protistranu ve stávajícím sporu. Nadnárodní společnosti jako F.  Hoffmann-La Roche A.G. rozhodně neschopní právníci nezastupují. Ba právě naopak. Přesto i tyto elitní týmy občas utrpí prohru, která má dalekosáhlé následky.

Každý, kdo jen trochu zná problematiku transfuzní služby a krevních bank, potvrdí, že bezpečnost příjemce krve a krevních derivátů musí být na prvním místě. Statistiky infekčních onemocnění však evidují množství infekcí přenesených krví a krevními deriváty. Chyba tak musí být v nedokonalé nebo málo citlivé diagnostice dárců. PCR technologie aplikovaná na přímý průkaz HIV, HBV a HCV přinesla naději i do tohoto segmentu. Připravovaná legislativní opatření Evropské unie, dle nichž se s platností od 1.  7. 2001 musí testovat každý dárcovský vzorek na HIV, HBV a HCV, a to pokud možno PCR, vedla odborníky v Roche k tomu, aby tehdy velmi pružně reagovali na nářky krevních bank a výrobců krevních derivátů nad zvýšenými náklady v důsledku testování, motivované předpokladem jejich mizejících zisků, a to ve dvou etapách. Nejprve došlo k vývoji testu AMPLICOR HIV Ultra Sensitive, kdy změnou postupu přípravy vzorku zvýšením otáček při centrifugaci na 19 000 (= 23 000 x g) v chlazené centrifuze se výrazně zvýšila citlivost diagnostické soupravy. Úspěšné zvýšení citlivosti vedlo k nápadu testovat tzv. pooly krevních vzorků a využít k tomu automatický dilutor firmy Hamilton. Vznikl tedy test AmpliScreen®.

Uspořádání testu AmpliScreen® bylo následující: Nejprve byly připraveny pooly z 24 zpracovaných vzorků a otestovány na HIV, HBV a HCV. Pokud byla zjištěna pozitivita některého z poolů, byly v rámci 24poolu připraveny 4 pooly po 6 vzorcích a ty následně otestovány. Po zjištění pozitivního 6poolu, bylo otestováno 6 vzorků individuálně a určen pozitivní. Ekonomika tohoto řešení spočívala při 240 odebraných dárcovských vzorcích namísto 720 individuálních testů v provedení 10 testů HIV, 10 testů HBV a 10 testů HCV při testování 24poolů, dále při jednom pozitivním 24poolu na jedno agens, v otestování čtyř 6poolů jedním testem a následném otestování 6 individuálních vzorků jedním testem. Bylo tedy provedeno 40 testů místo 720.

Časové nároky na provedení kompletního testu AmpliScreen® závisely na počtu analyzátorů COBAS® Amplicor a Hamilton (optimum 3 + 2) a na organizaci práce v laboratoři.

Interní školení pro pracovníky Roche bylo připraveno v Rotkreuzu v areálu Tegimenta AG. A tak jednoho červnového dopoledne roku 2000 jsme společně s MUDr. Igorem Blanárikem a MUDr. et RNDr.  Jurajem Šimkem, jenž měl zavádět tento test na Slovensku, vyrazili do Lucernu. Cestou nám Igor sdělil, že nás v Rotkreuzu očekává někdo, kdo se jmenuje Hui Hui Oh. Druhý den ráno se hlásíme na recepci Tegimenty plni očekávání, kdo se skrývá za jménem Hui Hui Oh. Dostáváme pokyn: „Pánové, posaďte se, slečna Vivi tu bude za chvíli.“ Vedoucí kurzu byla etnická Číňanka ze Singapuru, absolventka tamní univerzity, jejíž jméno se vyslovuje Vivijó. Po úspěšném absolvování kurzu jsme byli připraveni k provedení evaluačních studií. Test bohužel při průniku na evropský trh narazil na neočekávané překážky. Stalo se tak v důsledku soudního sporu mezi objevitelem viru hepatitidy C firmou CHIRON a Roche Diagnostics Systems Inc. o vlastnictví práv k využití genomu HCV. Nejprve soud v USA rozhodl, že živý, byť mikroorganismus nemůže být předmětem vlastnictví kohokoli. Rok nato soud v Evropské unii zaujal opačné stanovisko. V důsledku tohoto verdiktu každý výrobce molekulárně biologických testů HCV musel po dobu 20 let ochrany, tj. cca do roku 2013, platit licenční poplatky aktuálnímu držiteli práv – posledním z nich byla v důsledku série změn vlastnických vztahů firma Bayer AG. Vzhledem k nekonstantnímu počtu vyšetření HCV nebylo možné určit přesný objem vyšetření a licenční jednání nebyla úspěšná.

Významným fórem pro propagaci nových technologií byly kongresy mezinárodních odborných společností. V případě mykobakterií došlo k první prezentaci evaluačních studií na kongresu ESM v Pise v roce 1995, kde byly kromě testů Amplicor představeny i výsledky evaluační studie testu MTB Amplifi ed konkurenční firmy Gen-Probe Inc. na principu TMA. Test na principu LCR představila firma Abbott Laboratories na kongresu konaném o rok později na Pasteurově institutu v Paříži. Následovaly kongresy v Řeznu, Lisabonu a Lucernu, které potvrdily značné rozšíření uplatnění molekulárně biologických testů v diagnostice tuberkulózy a ostatních mykobakterióz v humánní i veterinární medicíně.

Pravidelný kontakt odborníků je pro rozvoj každého oboru velmi důležitý. V devadesátých letech sehrála zastoupení zahraničních společností velmi pozitivní roli v podpoře navazování mezinárodních kontaktů našich expertů tím, že financovala výjezdy na kongresy a sympozia. Z hlediska dnešních etických kodexů jsou podobné aktivity považovány za formu korupce, tehdy šlo o činnost naprosto běžnou, spojenou většinou s exkurzemi na renomovaná zahraniční pracoviště. Je třeba otevřeně říci, že při neexistenci zdrojů financování by se řada zejména mladých pracovníků do zahraničí těžko dostávala a úroveň celé české a slovenské medicíny by stagnovala. Podotýkám, že zakázat určitou činnost a označit ji za protispolečenský jev je pro politiky velmi jednoduché, stejně jako přenést náklady na soukromé osoby. Pravda, ve většině původních zemí EU již v té době platil zákaz pro státem zaměstnávané pracovníky přijmout takovouto firemní podporu. Na rozdíl od ČR je zde však jiná možnost, na niž se u nás poněkud pozapomnělo: každý tvůrčí pracovník v původních zemích EU má právo účasti na 2 profesně vzdělávacích akcích ročně. Náklady na tyto akce jsou odečitatelnou položkou od daňového základu. Mimo to jsou rozpočtové položky na cestovné v institucích financovaných z veřejných rozpočtů podstatně vyšší než u nás, o platech zaměstnanců nemluvě.

O tom, co znamenají zásahy politiků, se přesvědčili i organizátoři kongresu ESM ve Vídni v roce 2000. Parlamentní volby v Rakousku v roce 1999 skončily výrazným úspěchem Freie Partei Öester reichs, vedené korutanským hejtmanem, kontroverzním rakouským populistickým politikem Jörgem Haiderem. Možnost, že se tento neodhadnutelný politik bude podílet na vládě dokonce jako premiér, vedla orgány Evropské unie k bezprecedentnímu kroku – vyhlášení politických sankcí vůči Rakousku. Nastalo období politické izolace této členské země EU. Styky byly přerušeny nejen na politické a diplomatické úrovni, ale bojkotovány byly i mezinárodní akce pořádané v roce 2000 na rakouském území. Pracovníci všech organizací financovaných z veřejných rozpočtů či čerpajících státní nebo unijní dotace měli striktní zákaz služebních cest do Rakouska. Pořadatelství kongresu ESM nakonec postiženo nebylo. Předsedkyně organizačního výboru Dr. Roja Wejbora se v rámci snížení nákladů rozhodla namísto pronájmu konferenčního centra a rezervace prvotřídních hotelů uspořádat kongres v zařízeních univerzitního kampusu, byť za podmínky mírného posunu termínu konání na konec akademického roku. Sankce nesankce, kongresu se zúčastnili všichni pravidelní účastníci kongresů ESM ze všech zemí EU, tentokrát za své osobní finanční prostředky a za nižšího pohodlí. Solidarita vědecké komunity byla obdivuhodná.

Zastavte pendolino!

Na závěr tohoto článku mi dovolte opět jednu osobní vzpomínku: Na již zmíněný kongres ESM v Pise jsme odjížděli spolu s MUDr. Pavlem Henčlem, dvěma rakouskými kolegy a RNDr. Márií Švejnochovou (Nemocnice sv. Kríža v Podunajských Biskupicích) z vídeňského nádraží Südbahnhof lůžkovým vozem do Florencie, odkud jsme pokračovali lokálním vlakovým spojem do Pisy. Vystoupení obou rakouských kolegů bylo v první části programu, Maja a já jsme přednášeli později. Ubytováni jsme byli v hotelu naproti nádraží, ze dveří na peron asi 3 minuty. Jelikož Pavel Henčl s Rakušany odjížděl dříve a já naopak měl v Itálii ještě nějaké povinnosti v oblasti Veneto, byl jsem požádán, abych Maju doprovodil do Florencie a posadil ji do vlaku do Vídně, u něhož ji Pavel vyzvedne a autem odveze domů do Biskupic.

Vlak z Pisy odjížděl v 8.00, na florentinské nádraží Santa Ana přijížděl v 9.20, vlak do Vídně odjížděl v 9.30, při rozlehlosti nádraží Santa Ana času na přestup jen tak tak. V našem hotelu podávali snídaně až od 8 hodin, na lačno se nám odjíždět nechtělo. V předvečer odjezdu jsem se tedy vypravil na nádraží zjistit, zda neexistuje jiné spojení. V jízdním řádu byl uveden další vlak s odjezdem v 8.25 a příjezdem do Florencie v 9.10. Nebylo tedy co řešit.

V 9.20 stojíme se zavazadly na nástupišti nádraží v Pise. Rozhlas ohlašuje příjezd vlaku, který se objevuje za 3 minuty. Je to pendolino. Nastupujeme, zavazadla odkládáme do regálu u dveří, usadíme se do pohodlných křesel a užíváme si rychlou jízdu. V 9.00 zastavujeme na nástupišti označeném Firenze-Rivera. Po několika minutách nezvykle dlouhého stání jde kolem průvodčí. Táži se jí, kdy budeme na Santa Ana. Odpověď je překvapivá: „Tento vlak na nádraží Santa Ana nezajíždí!“ Vyskočili jsme ze sedadel, popadli kufry a hrneme se k východu. Dveře nám zacvakly přímo před nosem a vlak plynule nabírá rychlost. Otáčím se a sápu se po tlačítku nouzového zastavení. Průvodčí pochopila můj úmysl a jala se tlačítko chránit vlastním tělem. Přitom cosi křičela na kolegyni skrze prostor vagonu. Vlak mezitím dosáhl maximální cestovní rychlosti a řítil se směrem na Řím. Náhle začal zpomalovat. Brzdíme. Dveře se otevírají a my se ocitáme na liduprázdném nástupišti jiného florentinského předměstí. Pendolino mizí v dáli. Je 9.12. Z jízdního řádu na nástupišti zjišťuji, že za 3 minuty jede z opačného nástupiště vlak na Santa Ana. Mizíme v podchodu. S pětiminutovým zpožděním přijíždí souprava příměstské dopravy. Nastupujeme. Po necelých 10 minutách jízdy zastavujeme na kolejovém zhlaví nádraží Santa Ana. Po 5 minutách čekání, které se zdají být věčné, nás konečně pouštějí do nádraží.

Zastavujeme na 2. nástupišti, je 9.36. Spíše ze zvědavosti než s nadějí jdeme k 18.  nástupišti, z něhož odjíždí vlak do Vídně. K našemu velkému překvapení tam souprava ještě stojí. Nastupujeme do posledního vagonu a vlak se rozjíždí. Přichází průvodčí a informuje nás, že poslední 2 vagony soupravy nejedou do Vídně, nýbrž do Salcburku. Bereme zavazadla a vnitřkem soupravy procházíme do vídeňských vagonů. Něco tak přeplněného jsem viděl naposledy v roce 1990 v Orient expresu mezi Sofií a Istanbulem. Na chodbičce sedí cestující na kufrech, procházet lze jen velmi těžko. Ve čtvrtém vagonu od konce vidím v jednom kupé volné místo na polici pro zavazadla, kam umísťujeme své kufry. Místo k sezení volné není, nicméně jeden z cestujících vystupuje ve Ferraře – místo pro Maju do Vídně volné bude. Druhý vůz odsud je jídelní. Odcházíme tedy do něj. Chodbička je bez zavazadel podstatně průchodnější a při italské kávě cesta příjemně ubíhá. V cestujícím u vedlejšího stolu poznávám Jiřího Pelikána, před srpnem 1968 ředitele Československé televize, posléze významného představitele posrpnové emigrace. Jak se ukáže, cestuje na bienále do Benátek, kde na nádraží Santa Lucia oba vystupujeme.