article main title
Polymerázová řetězová reakce v průběhu třiceti let od první publikace, 4. část
MUDr. Emil Pavlík, CSc. 1
1) Ústav imunologie a mikrobiologie, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze, Studničkova 7, Praha 2. Odborný asistent katedry zdravotnických oborů a ochrany obyvatelstva Fakulty biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze se sídlem Sportovců 2311, Kladno. Vedoucí lékař Sérologické laboratoře Ústavu lék. biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN Praha.

První krok byl učiněn, PCR v podobě testů Amplicor zakotvila v Československu, nyní již bývalém. Nastala doba potřebné podpory prodeje. A aby nezůstalo u jednorázového nákupu z grantových prostředků, bylo třeba tuto technologii zavést do vznikajícího systému pojišťoven.

Pokus doc. Bednáře o nasmlouvání výkonu s VZP skončil nejprve na odmítavém stanovisku nově se formujícího vedení Všeobecné fakultní nemocnice (vznikla v roce 1993 sloučením FN I s P a FN 2 s FP), jednání jménem 1. LF zase na vyjádření, že ZP nejsou oprávněny uzavírat smlouvy se státními subjekty mimo rezort zdravotnictví. Nezbylo než se obrátit na nestátní zdravotnické zařízení. Volba padla na laboratoře fy ALIATROS spol. s r.o., s níž 1. LF uzavřela smlouvu o vedlejší hospodářské činnosti. Vyšetření byla nasmlouvána na náhradní kódy se souhlasem Společnosti pro genetiku. Dalším krokem důležitým pro rozšíření technologie do diagnostických laboratoří bylo prosazení kódu do Sazebníku výkonů pro obor 802 – lékařská mikrobiologie. K tomu byl třeba návrh odsouhlasený dvěma odbornými společnostmi: Společností epidemiologie a mikrobiologie a Společnosti klinické mikrobiologie a infekčního lékařství. Výbory obou společností návrh podpořily, takže mohl být odeslán do VZP a na MZ ČR. Zde však došlo k zádrhelu, nikdo se návrhem nezabýval, nikdo nic neprojednával, nikdo nic nevěděl, úředních lhůt proběhlo několik – a stále nic. Čas běžel. Na trhu se objevily tři nové soupravy: Amplicor Mycobacterium tuberculosis, Amplicor Hepatitis C Virus a souprava Amplicor HIV-1 RNA, umožňující přímý průkaz virové RNA v krvi pacienta, čímž se prakticky uzavřelo obávané diagnostické okno. Inovací prošla i souprava Amplicor CT, jež byla doplněna o Neisserii gonorrhoeae. Testy Amplicor si našly cestu do Národní referenční laboratoře (NRL) pro HIV a NRL pro mykobakterie v SZÚ, následně i do NRL pro virové hepatitidy. Diagnostické laboratoře i přes čilou přednáškovou činnost prakticky na všech kongresech, sympoziích i pracovních dnech společností stále váhaly. V napjaté ekonomické situaci neustále rostoucích cen vstupů a plynule se snižujících příjmových položek, kdy nebylo jasné, zda pojišťovny budou vůbec výkon hradit, nebylo divu.

Situaci vyřešila náhoda. Jak jsem již uvedl v minulé části, věnoval jsem se v té době i žurnalistice. Protože náš týdeník Statim byl distribuován všem lékařům zdarma, stal se celkem populárním fórem pro různé aktuality ze zdravotnických zařízení. Do redakce nám chodily pozvánky na plejádu zajímavých akcí, které se náš kolektiv redaktorů snažil zpravodajsky pokrýt. Jedním z mých úkolů byla účast na besedě Hradeckého lékařského klubu  
s tehdejším ředitelem VZP. Vydal jsem se tedy do Hradce Králové. Beseda byla zajímavá, pan ředitel ochotně, a nutno říci velmi otevřeně, odpovídal na otázky lékařů. Po besedě jsem pana ředitele požádal o upřesnění některých jeho vyjádření pro článek v našem periodiku a mimo jiné jsem se zmínil o situaci s výše zmíněnými kódy a požádal jej o radu. Dostal jsem vizitku s tím, abych kopii návrhu se všemi náležitostmi co nejrychleji doručil do jeho sekretariátu, ostatní že zařídí. Uposlechl jsem a v novém vydání Sazebníku výkonů zdravotních pojišťoven se pro odbornost 802 objevily kódy 82041 Průkaz DNA infekčního agens hybridizační sondou po amplifikaci a 82043 Průkaz RNA infekčního agens hybridizační sondou po amplifikaci (později byly přečíslovány na 82039 a 82041 a vydržely v nezměněné podobě až do roku 2016). Nyní již nic nebránilo dalšímu rozšíření molekulárně biologického průkazu infekčních agens v ČR, a to nejen testy Amplicor.

Thomas White                           Betty Dragon                        Shirley Kwok                        Henry Erlich                        David Gelfand

Show me a real customer

Náběh prodeje testů Amplicor však nebyl bůhvíjaký ani u našich sousedů. V Rakousku bylo v roce 1993 testování prováděno ve 4 laboratořích, nárůst v Německu byl sice plynulý, ale teritoriálně nerovnoměrný, v porovnání s vídeňskou filiálkou pro východní Evropu však přece jen úspěšnější. Ředitel dr. Leidl se netrpělivě dotazoval MUDr. Henčla na situaci a umístění do NRL považoval za cenné z hlediska schvalovacích procesů v jednotlivých státech, a tedy za samozřejmost. Nejčastějším závěrem byla věta: „Show me one real customer!“ A tak jsme s panem docentem Bednářem vyrazili do Vídně. Kromě návštěvy Diagnostické divize Roche jsme si prohlédli laboratoře Algemeine Krankenhaus a Donauspital, kde jsme měli možnost seznámit se vedle testů PCR také s nově instalovaným laboratorním informačním systémem plně propojeným s NIS, a následně také dvě soukromé laboratoře. Z hlediska navázání kontaktů s rakouskými kolegy a především převzetí jejich zkušeností byla tato akce velmi přínosná. S přibýváním nových zákazníků začala mít Diagnostická divize Roche ve Vídni potíže s jejich zaškolením v Kaiseraugstu. Jednak se nedostávalo termínů, jednak při průměrných nákladech 40 000 CHF na jednoho zaškoleného přestávala stačit příslušná roční rozpočtová položka. MUDr. Pavel Henčl proto přišel s nápadem pořádat kurzy v Praze. Vedení v Basileji souhlasilo s podmínkou, že program bude zajištěn převážně lektory z Kaiseraugstu, a to i externími. ÚLM 1. LF UK poskytl výukové prostory a laboratorní servis a na teoretickou část dorazili dr. Hans-Joachim Burkhardt a profesor Guiseppe Colluci.  
V průběhu týdne bylo vyškoleno prvních 12 zákazníků. 

Počet byl omezen poměrně stísněnými prostory laboratoře. Reakce zahraničních lektorů na podmínky v ÚLM byla dvojí: Hans Burkhardt byl optimistický, Beppo Colluci, zvyklý na vybavení své mateřské milánské univerzity, naopak skeptický. Jeho skepse pro nás byla podnětem k bezodkladnému využití laboratoří uvolněných po reorganizaci ústavu osamostatněním oddělení imunologie. Získali jsme 3x větší prostory, nedostatek laboratorního nábytku jsme vyřešili odkoupením výstavní předváděcí sestavy firmy Linet, což nebylo investičně náročné. Profesor Colluci se nám při další návštěvě za své předchozí vyjádření omluvil. Kurzy se pořádaly 4–5x ročně pro max. 25 účastníků. Celkem jimi prošlo 226 odborníků ze 16 zemí Evropy. Hosty ústavu byli i vysocí představitelé managementu Roche Thomas White, Betty Dragon, Monica Stapleton a další. Reportáž z PCR laboratoře ústavu byla zveřejněna v globálně distribuovaném časopisu Benchmark, tematicky výhradně zaměřeném na PCR diagnostiku.

Spektrum testů Amplicor, které byly k dispozici koncem roku 1994, zahrnovalo CT/NG, MTB/MAV, HIV-1 provirus DNA, HIV-1 RNA, HCV. Tyto soupravy reagencií byly velmi robustní, vysoce citlivé a specifické. Pamatuji si na příspěvek na přednáškovém dni v Lékařském domě v Praze, z něhož vyplynuly evaluované výsledky získané za použití čtvrtinového objemu reagencií Amplicor pro individuální reakci. Všechny verze souprav na trhu již byly vybaveny interní kontrolou funkce polymerázy na koamplifikačním principu (podrobnosti viz část 2), což vyloučilo možnost distribuce falešně negativních výsledků v důsledku inhibice. Zároveň se tak vytvořily předpoklady pro vznik kvantitativních diagnostických souprav určujících mikrobiální nálož pacienta.

Testy Amplicor Monitor

Institut epidemiologie a mikrobiologie N. F. Gamaleie v Moskvě

V pokračujícím vývoji manuálních testů byly připraveny soupravy Amplicor HIV-1 Monitor a Amplicor HCV Monitor. Šlo o kvantitativní testy pracující na principu kompetitivní amplifikace nukleové kyseliny infekčního agens s kvantifikačním standardem. Tyto testy se významně uplatnily ve farmaceutickém průmyslu při testování nově vyvíjených léků proti HIV, tzv. proteázových inhibitorů. Určitou nevýhodou této verze testů byla o řád nižší citlivost ve srovnání s testem kvalitativním a též poměrně složitá detekce vyžadující velmi přesné ředění a pipetování všech detekčních reagencií, aby nedošlo k ovlivnění výsledku, stanovovaného výpočtem, laboratorní chybou. Dokonce byla zkonstruována dvanáctikanálová programovatelná elektronická mikropipeta pracující se zvlášť dlouhými špičkami. Pomůcka to byla perfektní, bohužel její prodejní cena se pohybovala kolem 2 000 CHF, což si většina laboratoří nemohla dovolit.

Nové testy potřebovaly nová školení a další přednášky doma i v zahraničí. Vedení Diagnostické divize Roche GmbH. ve Vídni se rozhodlo nabídnout mi konzultační smlouvu. Rád jsem ji přijal, a to nejen z důvodu ekonomické motivace. Zaručovala mi totiž všechna odborná školení v rámci firmy. Nastala doba cestování. Měl jsem dvě výhody: 9 týdnů dovolené vysokoškolského učitele pracujícího v rizikovém prostředí a absenci rodiny. Musel jsem pouze výrazně utlumit své novinářské aktivity. Z týdeníku Statim jsem přešel do měsíčníku Medicína, z pozice zástupce šéfredaktora na pozici odborného redaktora, až jsem tuto činnost později zcela ukončil. Také jsem oprášil své znalosti ruského jazyka. Začala invaze na největší trh východní Evropy – Ruské federace.

Poslední dekáda 20. století v Rusku

Poslední dekáda 20. století byla ve znamení převratných změn v ruské společnosti. Po rozpadu Sovětského svazu si Rusové jen pomalu zvykali na život v nových podmínkách a nebylo to pro ně vůbec snadné. V podmínkách prezidentského systému nebyl Jelcin v žádném případě ideálním vůdcem pro transformaci společnosti a nutno říci, že ani jemu samotnému nebyl alkohol dobrým rádcem a totéž platilo pro miliony běžných občanů. Rozhodujících hospodářských jednotek se zmocňovaly jednak stranické nomenklaturní kádry, jednak dobrodruzi působící v šedé ekonomice již v sovětských dobách. Podniky závislé na odbytu v bývalých sovětských republikách, nyní samostatných státech, nebo na exportu do zemí rozpadlé RVHP postupně krachovaly a doslova chrlily nové nezaměstnané. Pokud podniky ještě vyráběly, měly většinou potíže s výplatami zaměstnanců. V některých regionech byla celá města plná obyvatel bez peněžních příjmů. Fungoval tedy výměnný obchod. Rostoucí spolupráce s Japonskem vedla k ekonomickému vzestupu „Dálněvýchodního ekonomického rajonu“, kam odcházeli otcové rodin zpravidla na 3 měsíce, aby si vydělali prostředky k pokrytí životních nákladů rodiny po zbytek roku. Kurz rublu se kontinuálně propadal (když jsme přijeli do Moskvy v roce 1995, byl směnný kurz 5 360 rublů za 1 dolar, když jsme za týden odjížděli, dosáhl 5 730). Vyplácené důchody a mzdy se však nezvyšovaly. Zbohatlíci se rovněž rozdělili, vznikla vrstva oligarchů vlastnících velké ekonomické subjekty, kteří své postavení dávali najevo nákupem superluxusního zboží, automobilů, vrtulníků, letadel a námořních jachet, a vrstva tzv. nóvych Růsskych.

Programovatelná multikanálová automatická mikropipeta pro manuální verzi kvantitativních testů Amplicor-Monitor

Zatímco oligarchy lze nalézt v honosných sídlech i mimo území Ruska, „nóvyje Růsskije“ vystavují své bohatství na odiv převážně doma. V té době to byli zpravidla mladí lidé – muži vyšších hmotnostních kategorií v drahém značkovém oblečení s mobilním telefonem, zlatými rolexkami na zápěstí a masivním zlatým řetězem kolem krku, vysedávající v nejdražších barech a restauracích. Dámy se zlatými kreditními kartami bylo možno nalézt v obchodech se značkovým luxusním zbožím, jichž bylo zejména centrum Moskvy plné, nebo za volanty SUV dražších značek, případně na cestách po světě. Velmi vytížené byly letecké linky z Moskvy do Miami, New Yorku, Nice, Paříže, Londýna, Vídně, Atén, do Turecka, Dubaje, na Kypr, do Španělska, Egypta a dalších populárních destinací včetně Prahy a Karlových Varů. Obě skupiny byly navíc doprovázeny určitým počtem přísně se tvářících vyholených hromotluků se saky vyboulenými na typických místech. Střelba v ulicích nebyla sice častá, avšak ani výjimečná. Běžní obyvatelé Moskvy žili za zamřížovanými okny paneláků, svůj majetek chránili bezpečnostními dveřmi s několika zámky, nakupovali na tržištích, jezdili v moskvičích, žigulících a záporožcích, které postupně držel pohromadě pouze lak, nebo v přeplněné MHD. Do metra vstupovali po vhození plastového žetonu, který nahradil původní pětikopějkovou minci (1 rubl = 100 kopějek) a měl výhodu proměnné hodnoty v závislosti na inflaci, do otvoru uzavřeného turniketu. Tramvaje T3 vyrobené v pražské Tatře Smíchov vypadaly ještě poměrně zachovale, totéž lze říci i o trolejbusech sovětské produkce, zato autobusy Ikarus měly nezřídka pár oken zasklených navařeným plechem (náhradních dílů bylo málo) a táhl se za nimi oblak černého dýmu ze špatně spalované nafty. Některé čtvrti procházely bouřlivou developerskou přestavbou. Vznikaly zde domy s luxusními byty. Na autobusových linkách MHD obsluhujících tyto sídelní celky byly nasazeny nové Mercedesy. Přestože většina obyvatel čelila poměrně tvrdým životním podmínkám, mezilidské vztahy zůstávaly srdečné. Mnohokrát jsem si tehdy vzpomněl na výrok Ing. Jána Neubauera, který mi někdy v roce 1994 při našem setkání v Bratislavě na můj dotaz, jak se má, odpověděl: „Máme sa zle, ale dobre to znášame.“ Pro Rusko té doby to sedlo dokonale.

Ruské zdravotnictví čelilo v té době vážné epidemiologické situaci, která vznikla součinem několika faktorů. Prvním byl rozklad sovětského systému preventivní péče. Složitá ekonomická situace v zemi sice výrazně snížila výskyt obezity, ale nedostatek kvalitních potravin na trhu trvající již od sovětských časů Gorbačovovy perestrojky se projevil na poklesu imunity. Jelcinova amnestie rozptýlila jedince s otevřenou formou tuberkulózy po celém teritoriu země, což mělo závažné epidemiologické důsledky, zintenzivnění prostituce vedlo ke značnému nárůstu onemocnění přenosných pohlavním stykem včetně AIDS, nedostatek zdravotnického materiálu na jedno použití vedl k nákazám hepatitidami typu B a C, zhoršení hygienických podmínek vyústilo v epidemii střevních infekcí a v kategorii dětských infekcí suverénně vedl záškrt. Trh laboratorní diagnostiky měl dobré perspektivy, až na jedinou – chyběly finance. Byl zde však cenný lidský potenciál. Stagnující vojenský průmysl uvolnil pro civilní sektor řadu zkušených špičkových odborníků – inženýrů rozličných technických oborů, biochemiků i mikrobiologů. Někteří z nich založili firmy produkující přístroje a pomůcky pro zdravotnictví, laboratoře nevyjímaje. Na ruském trhu se objevily i laboratorní přístroje pro molekulárně biologické techniky. Moderní, levné a spolehlivé. Navíc z velmi kvalitních materiálů. Po odzbrojovacích dohodách výrazně poklesla například spotřeba titanové oceli používané v leteckém průmyslu a na pláště raket. Produkce však pokračovala dál. Nikde jinde na světě jste nedostali zahradnické nebo kuchyňské potřeby z titanu – jen v Rusku! Výstižně to popsal jeden z prvních pracovníků moskevské kanceláře Ф. Хоффманн – Ля Рош Oleg Něstěrov: „Ránše u nás iz titánnoj stáli samoljóty i rakéty strójili. A sičás kastrůli i lopáty vypuskájut. Govorját tomu konvérzija!“

Dalším faktorem, který podpořil vstup testů Amplicor na ruský trh v poměrně značném objemu, byla skutečnost, že infekční nemoci postihovaly všechny vrstvy obyvatelstva, včetně oligarchů a „nóvych Růsskych“ – tedy těch vrstev společnosti, které peníze měly. Protože AIDS a hepatitida C byly v té době považovány za nevyléčitelné a smrtelné nemoci, poptávka po vyšetření rostla. Soukromé laboratoře rozhodně nezahálely. Zajímavostí bylo, že jedním z obchodních partnerů Roche v Rusku byla společnost vyrábějící vlastní PCR testy, čímž porušovala patentovou ochranu testů Amplicor. Vedení společnosti F. Hoffmann-La Roche AG o tom vědělo, avšak nezasáhlo. Osobně si nemyslím, že důvodem byla pouze nedostatečná vymahatelnost ochrany mezinárodních autorských práv v Ruské federaci. Ona firma totiž pro potřeby evaluace jednotlivých šarží své několikanásobně levnější produkce využívala testů Amplicor, které kupovala u Roche Diagnostics, a to v nemalém množství. Jejími zákazníky byly převážně laboratoře v regionech bývalého SSSR, které by používání originálních souprav Amplicor finančně nezvládly, takže šance na získání tohoto tržního segmentu byla mizivá. Většina diagnostikovaných HCV infekcí však vedla k pokusu o léčbu interferonem alfa-2. A hádejte, kdo prodával do Ruska Roferon A?

Při pobytech v Rusku jsme zažili obrovská vedra i kruté zimy. Pravdou je, že přežít vedra nám usnadňoval klimatizovaný luxusní hotel Aerostar (s cenou za nocleh bez snídaně 325 USD vpravdě nekřesťanskou) a klimatizované služební Volvo. Pokud však teplota v zimě stoupla nad +10 °C, ve státních budovách se většinou buď netopilo vůbec, nebo jen omezeně. Tam jsme však trávili většinu času. Na odděleních a v laboratořích nemocnic bylo celkem teplo, zato konferenční sály i přes upřímnou snahu organizátorů o rychlou změnu často připomínaly čerstvě otevřenou chladničku. Pokud předmětem podpory našeho týmu byly testy na hepatitidy, doplňoval nás dr. Michail Michajlov, vedoucí Národní referenční laboratoře pro hepatitidy z Institutu pro epidemiologii a mikrobiologii Nikolaje F. Gamaleie v Moskvě. Skutečnost, že lékaři to v Ruské federaci té doby neměli lehké, byla mimo jakoukoli pochybnost. Přesto nás zkušenost, o níž nám Michail vyprávěl, šokovala. Dovolím si ji vložit do úst dr. Michajlova v českém překladu a uvést ji zde jako svérázné svědectví té doby…

„Seděl jsem ve své pracovně v Institutu a vyplňoval nějaké hlášení, když kdosi rozrazil dveře. Vstoupila trojice mužů – jeden elegán a dva typičtí bodyguardi. – „Jste doktor Michajlov?“ – „Ano.“ – „Vy jste prý nejlepší odborník na virové hepatitidy v Ruské federaci.“ – „Děkuji za ohodnocení, něco snad o nich vím,“ odpověděl jsem. „Já zde mám výsledky vyšetření mé ženy ze dvou laboratoří,“ pokračoval elegán. „Jedna laboratoř uvádí, že manželka má hepatitidu C, druhá, že ne. Určete, které vyšetření je správné, já to v té druhé laboratoři vyřeším…“ Pochopil jsem, že řešení bude nejspíš s využitím Kalašnikovova automatu. Naštěstí šlo  
v obou případech o vyšetření specifických protilátek proti viru HCV a podle dat uplynulo mezi negativním a pozitivním výsledkem 13 dnů. Pokusil jsem se dotyčnému vysvětlit, že oba výsledky mohou být správné. Zjevně mi příliš nevěřil. Bodyguardi zatím vyplnili dveře. Doporučil jsem další vyšetření přímým průkazem virové RNA. – „Můžete manželku vyšetřit u Vás?“ zeptal se. Na životě sice nelpím, určitý pud sebezáchovy však mám: „To bohužel nebude možné, na vyšetřování pacientů zde nejsme zařízeni. Řada moskevských laboratoří již technologii RT-PCR má, dokonce i jedna z těchto dvou.“ – „Děkuji Vám, doktore! Na shledanou.“ – „Na shledanou,“ odvětil jsem a myslel si: Proboha, jen to ne!“ 

Pokračování příště

MUDr. Emil Pavlík, CSc.

MUDr. Emil Pavlík, CSc.


Absolvent FVL UK v Praze 1980, obor Všeobecné lékařství, atestace z lékařské mikrobiologie II. stupně 1998, licence ČLK pro vedoucího lékaře-primáře 2000, CSc., v oboru Genetika 2001, školitel PGS v doktorském studijním programu FBMI.

Ústav imunologie a mikrobiologie 1. LF UK a VFN, Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN v Praze, Katedra zdravotnických oborů a ochrany obyvatelstva FBMI ČVUT Kladno.

Literatura
  1. Paul Rabinow: Making PCR. A Story of Biotechnology The University of Chicago Press 1997. ISBN 0.226-70147-0.
  2. Sazebník výkonů zdravotních pojišťoven MZ ČR 1995

  3. www.gamaleya.ru

  4. https://bloomberg.com/research/stock/private/person.asp?personid=117179aprivca-pld=401184aprevicusCapId=4011884aprevious title =celera%20corporation

  5. www.linkedin.com/in-thomas-j-white2946709

  1. https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/index.html
  2. www.Google/maps/streetview/ 8 Gamaleya Street Moscow
  3. Archiv autora
Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.