article main title
Kterak se bilirubin potkal s paraproteinem v těsné kyvetě
RNDr. Pavel Škrabálek 1 , Ing. Pavel Prouza 2
1) Centrum laboratorní medicíny, Krajská nemocnice Liberec
2) Roche s.r.o., Diagnostics Division

Dovolte mi oprášit jednu větu, která se vyskytuje v mnoha příbalových letácích, kde je zpravidla pominuta, aby se pak její praktické projevy objevovaly v odborné literatuře. Věta zní: Ve velmi vzácných případech gamapatie, především IgM (Waldenströmova makroglobulinémie), může způsobit nespolehlivé výsledky. Rád bych vám popsal, jak jsme se v Liberci potkali s jejími konkrétními projevy, které kolega rozvinul a uvedl do souvislostí.

Poněkud poetický úvod

Léto je krásný čas. Počet vzorků protékajících laboratoří klesne, dovolené odčerpají část pracovníků a zbytek se většinou soustředí na práci, vyhýbá se průšvihům, čímž roste produktivita. Klesá i počet vzorků zasílaných Společností pro extrémní kontrolu kolegů, dokonce i vrcholné orgány Společnosti ustávají v chrlení doporučení a společně s akreditačními pracovníky nabírají síly k dalšímu páchání dobra v podobě zvyšování kvality v laboratořích od zeleného stolu. V ten moment má člověk šanci zachytit a věnovat se dříve běžným zájmům, třeba lovit biochemické zvláštnosti. Tak jsem potkal praktické dopady výše zmíněné věty z příbalového letáku.

Nález

Při potvrzování výsledků z analyzátorů jsem si všiml opakovaně stanoveného celkového bilirubinu, automaticky iniciovaného analyzátorem. Podivné na tom bylo to, že prvotní výsledek byl 54 μmol/l s hláškou „Prozone“, a opakované stanovení (automatický rerun) poskytlo výsledek 5 μmol/l. S ním byl stanoven i přímý bilirubin s hodnotou 3 μmol/l. Po tomto vzorku zůstal otazník. K čemu došlo? Co to bylo a jak souvisí Prozone se stanovením bilirubinu, když je primárně určen ke sledování nerovnováhy antigenu/protilátky v imunoturbidimetrických stanoveních? Pak zafungovala shoda náhod. Efekt se zopakoval a současně jsem potkal článek z kongresového sborníku z Istanbulu.1 Pak už to bylo jen lehce vzrušující pátrání.

Literatura aneb co není v hlavě

Během exkurze do minulosti jsem se setkal opět se společností Boehringer Mann-heim, která si nechala složení reagencií pro stanovení celkového bilirubinu patentovat. Když si vezmete patent CA2254357A1 z roku 1999 (publikovaný též jako DE69801266D1, EP0918220A1, EP0918220B1, US5935861) a porovnáte se současným bezpečnostním listem soupravy, zjistíte, že se moc nezměnilo, surfaktant Triton, rozpouštědlo sulfolan ((CH2)4SO2), kyselina 4-aminobenzoová atd. To znamená, že odtud změna nepochází. V časové ose o něco blíž k současnosti se počínají objevovat články shodně popisující náhodné zvýšení hladiny bilirubinu u pacientů s paraproteinem IgG nebo IgM, jehož velikost překračuje několik desítek gramů na litr. Velice pečlivý v dokumentaci tohoto fenoménu byl Lirion Pantanowitz,2 který roku 2003 na reakčních grafech z Hitachi 917 dokázal odlišný průběh reakce, aby to završil zkumavkovým testem, ve kterém sérum s paraproteinem přidané k reagenciím způsobilo místo červeného zabarvení zákal. 

Tab. 1: Tabulka všech výsledků pacientů s paraproteinem vyšším než 40 g/l a jejich další výsledky. Červeně jsou zvýrazněny záznamy s reagenciemi BILTS. Zeleně jsou podbarveny záznamy s rerunem. Výjimkou je pacient K.E., který splňuje předpoklady, ale byl bez rerunu.

O rok později k dokonalosti přivedla technickou stránku fenoménu Agata Smogorzewska.3 Se svým kolektivem nejenže potvrdila možnost náhodného zvýšení výsledku bilirubinu reagenciemi nyní již Roche na Hitachi 917, ale rozšířila to i na arteficiální snížení hodnot výsledků stanovení HDL přímou metodou. Navíc vymysleli způsob, jak na atypický průběh reakce při stanovení celkového bilirubinu upozornit. Použili k tomu právě nastavení sledování Prozone, které je součástí každé definice aplikace Roche metody. Neznám pochopitelně souvislosti, ale dělá to na mne dojem, že nedávno nastoupivší BIL-T 3. generace pro systémy cobas® má v sobě zabudován tento mechanismus v pečlivě vyladěném provedení. Nasvědčuje tomu článek dvojice Andries J. Bakker, Matthias Mücke,4 ve kterém jsou prezentovány výsledky spojení odborníka na problematiku interference paraproteinů a zástupce firmy vyrábějící krmivo pro naše nenasytné systémy, který si uvědomuje narůstající frekvenci výskytu paraproteinémií a nebezpečnost v nepředvídatelnosti jejich účinků. Je vcelku lhostejno, zda se tak děje kvůli prodlužujícímu se věku pacientů, nebo za to může snížená kvalita životního prostředí a životní styl. Jejich popis způsobu interference se trochu liší od předešlých autorů. Tvrdí, že k precipitaci dochází až po přidání činidla R2. Používají však reagencie Bilirubin Liquid a falešné zvýšení absorbance je na systému MODULAR D detekováno pomocí funkce Prozone. Autoři připomínají, že podchycení interferencí paraproteinu, monoklonální komponenty, je prakticky neřešitelný problém, závisející na zajištění rozpustnosti paraproteinu během měnících se podmínek reakce. Do té doby jsem si neuvědomil, že hraje svou roli i materiál. Plazma obsahuje fibrinogen, jehož látková hmotnost nemusí být vždy do 4 g/l. Takže objem bílkovinné složky se může rychleji dobrat meze rozpustnosti. Počítat je nutné i s multiplikačním efektem přítomnosti heparinu.

Vedlejší efekt vylepšení aplikace

Zpět do provozu. Co když jsem si rerunů dříve nevšiml? Faktem však je, že aplikace pro BIL-T gen. 3 se od předchozích, BILTS a BILT2, poněkud liší (obrázky). Bohužel ke starším Modulárovým již nemám přístup. Zde by šlo povídání uzavřít a konstatovat smutně, že jsme zase nenalezli nic nového. Jen jakýsi vedlejší efekt vylepšení aplikace, která měla upozorňovat na možná chybná měření vysokých koncentrací bilirubinu. Proč však házet hned zkumavky do odpadu? Vždyť lze alespoň rozšířit využití stanovení sérových indexů! V obou systémech cobas®, které provozujeme, jsou sérové indexy nastaveny tak, že do LISu jsou přenášeny oproti originální aplikaci lehce upravené hodnoty. Hemolýza v mg/l hemoglobinu, chylozita v mg/l Intralipidového ekvivalentu a ikterita v mmol/l bilirubinu. Dosud byly výsledky takto nastavených sérových indexů využívány k okamžité indikaci interference u výsledků, což systém cobas® 8000 umí, a dokonce jimi dokáže ve formě značek/flagů zásobovat informační systém. Nebo lze porovnávat výsledky stanovení bilirubinu s hodnotami ikterity. Již teď mám jistotu, že u pediatrických vzorků není vyšetření zkresleno chybným pipetováním, třeba kontaktem jehly s boční stěnou mikrozkumavky, kdy hrozí nasátí menšího objemu vzorku, než je požadováno. Stejné pravidlo může být tedy použito i na nižší hladiny bilirubinu a ikterického indexu pro případ, že by selhala indikace Prozone. Prakticky totéž doporučuje Chelsea A. Sheppard.5

Obr. 1: Výřez obrazovky aktuální aplikace BIL-T gen. 3
Obr. 2: Výřez obrazovky předchozí aplikace BILT2 a BILTS (níže)

Analýza výsledků

Ku pomoci ve fázi určení četnosti výskytu tohoto fenoménu přišel informační systém. Podmínkový export dokáže vytáhnout z databáze prakticky všechny možné informace třeba od 1. 1. 2014, tedy záznamy kombinace metod bilirubin, celková bílkovina, paraprotein, volné řetězce kappa, lambda. Jediné, co se musí udělat ručně, je zkontrolovat historii výsledku bilirubinu, zda nedošlo k rerunu. Pak následuje, kuchařskou terminologií řečeno, redukování vývaru. Dne 21. 3. 2014 byla nasazena souprava BIL-T 3. generace. Do té doby byla používána souprava BILTS a výsledky jí stanovené je tedy nutno vyloučit, protože je již nelze ověřit. Pomocí analýzy zbývajících takřka 250 záznamů vzorků, které vyhledal informační systém a obsahovaly kombinaci stanovení bilirubin, celková bílkovina, kvantifikovaný paraprotein, imunoglobuliny, lze říci, že efekt nastává, když paraprotein, kvantifikovaný na základě elektroforézy bílkovin, překročí hranici položenou lehce nad 40 g/l.

Při poklesu paraproteinové frakce pod tuto hodnotu efekt mizí, což bylo zaznamenáno u dvou pacientů ze šesti nalezených. U dvou pacientů byl pozorován nárůst hodnoty paraproteinu s následnou inicializací rerunu při stanovení bilirubinu překročením parametrů Prozone. Raritou pak je jedinec, u něhož byl zaznamenán nárůst paraproteinu s aktivací rerunu a vymizením při poklesu paraproteinémií. Podle několika pacientů však nelze usuzovat na jiné zákonitosti. I když lze konstatovat, že jsme se nesetkali s jiným zákal tvořícím paraproteinem než třídy IgG. Na druhou stranu by bylo vhodné prověřit průběhy stanovení u vzorků, které zůstaly těsně pod vrcholem, zda nastavená hodnota Prozone dokáže zachytit vždy vznik zákalu společně se zabarvením reakční směsi. Lze však měnit hodnoty Prozone? Bohužel nikoliv. Leda byste si postavili aplikaci na volný, tzv. vývojový kanál.

Graf 1: Graf průběhu reakce s interferencí (kolečka) a normálních vzorků (ostatní) s vyznačenými měřícími body. (Vytvořeno pomocí funkce Overlay na cobas® 8000.) Je zde patrné, že zákal se začíná tvořit již po přidání R1 (silně kyselé prostředí pH1).
Originální dokumentace stejného jevu na modulu c 501, pro který se zařazení kontroly Prozone do aplikace plánuje. 
Graf 2: Graf vztahu stanovovaného bilirubinu (souprava BIL-T 3. gen) a fotometricky měřené ikterity jako sérového indexu.

Zpět na začátek

Dovolím se vrátit k úvodní větě. Jistě jste si všimli určitého rozporu. My jsme nalezli interference u paraproteinů třídy IgG, a upozornění hovoří o gamapatii a zdůrazňuje třídu IgM. Vysvětlení nemám, leč mohu se dohadovat, že v třídě IgM se vyskytují řidčeji paraproteiny s vysokou gramáží a současně ochrana soupravy proti vzniku zákalu přestane fungovat po překročení hodnoty 40 g/l, a to ještě ne vždy. Potěšitelným faktem je skutečnost, že ve srovnání s literaturou nikdy nepřesáhla falešně zvýšená hodnota bilirubinu 60 μmol/l a hodnoty změřené v rerunu se sníženým objemem vzorku odpovídají hodnotám indexu ikterity. Zcela stranou zůstalo stanovení HDL cholesterolu, které by dle literárních pramenů mělo být ovlivňováno též. Bohužel se v hledané kombinaci prakticky nevyskytlo. Hematologická ambulance, ze které pocházela většina vzorků, frakce cholesterolu většinou nevyšetřuje. Kdo by měl zájem, výčet metod, které jsou ovlivněny vyššími hladinami paraproteinové složky séra, se snažil postihnout M. Berth8 a mnozí další se zabývají dokumentací jednotlivých případů a případně prevencí chybných výsledků. Vliv paraproteinu se nesoustřeďuje na jednu konkrétní firmu, a dokonce jde o vliv multioborový. 

RNDr. Pavel Škrabálek

RNDr. Pavel Škrabálek


Ing. Pavel Prouza

Ing. Pavel Prouza


Literatura
  1. Seimiya M., Y. Suzuki, T. Yoshida, Y. Sawabe, K. Matsushita, F. Nomura, The Abnormal Reaction Data-detecting Function of the Automated Biochemical Analyzer Was Useful to Prevent Erroneous Total Bilirubin Measurement and to Identify Monoclonal Proteins, Poster, Istanbul.
  2. Pantanowitz, L., G. L. Horowitz, J. N. Upalakalin, and B. A. Beckwith. Artifactual hyperbilirubinemia due to paraprotein interference. Arch Pathol Lab Med 2003. 127:55-59.
  3. Smogorzewska, A., J. G. Flood, W. H. Long, and A. S. Dighe. Paraprotein interference in automated chemistry analyzers. Clin Chem 2004. 50:1691-1693.
  4. Bakker A. J., Mücke M. Gammapathy interference in clinical chemistry assays: mechanisms, detection and prevention Clin Chem Lab Med 2007; 45(9):1240-1243.
  5. Sheppard, C. A., R. C. Allen, and G. E. Austin, et al. Paraprotein interference in automated chemistry analyzers. Clin Chem 2005. 51:1077-1078.
  6. Nauti, A., A. Barassi, G. Merlini, and G. V. d'Eril. Paraprotein interference in an assay of conjugated bilirubin. Clin Chem 2005. 51:1076-1077.
  1. Dutta, A. K. A Curious Case of Hyperbilirubinemia, Ind J Clin Biochem (Apr-June 2012) 27(2):200-201.
  2. Berth M., Delanghe J. Protein precipita-tion as a possible important pitfall in the clinical chemistry analysis of blood samples containing monoclonal immunoglobulins: 2 case reports and a review of the literature. Acta Clin Belg 2004; 59:263-73.
  3. Yusong Yang, MD, PhD; Peter J. Howanitz, MD; Joan H. Howanitz, MD; Helen Gorfajn,MS; Keung Wong, MS, Paraproteins Are a Common Cause of Interferences With Automated Chemistry Methods. Arch Pathol Lab Med. 2008 Feb;132(2):217-23.
  4. Kadri N., Douville P., Lachance P. Monoclonal paraprotein may interfere with the Roche direct HDL-C Plus assay. Clin Chem 2002; 48:964.
Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.