Vliv vitaminu D na regulaci koncentrace kalcia a metabolismus kostní tkáně je již dlouhá desetiletí znám, novější studie prokazují další extraskeletální vlivy tohoto hormonu. Receptory vitaminu D byly nalezeny v řadě tkání, dá se tedy předpokládat velmi rozmanitý účinek na zdraví člověka.

Úvod

V důsledku zvýšeného zájmu o vitamin D v příčinné asociaci se širokým spektrem onemocnění se také dramaticky zvýšil počet požadavků na vyšetření koncentrace vitaminu D, resp. celkového 25-hydroxyvitaminu D (25(OH)D). Avšak vzhledem k různým nepříznivým faktorům, jako je hydrofobicita molekuly, vazba na bílkovinné přenašeče a přítomnost řady různých metabolitů vitaminu D, je stanovení obtížné a stále se potýká s určitými analytickými problémy.
Navzdory tomu, že je ID-LC-MS/MS ustanovena referenční metodou stanovení vitaminu D, v laboratořích se rutinně používají snadnější a rychlejší automatizované imunochemické metody. Tyto však nejsou dosud dostatečně standardizované, prozatímní pozitivní efekt výsledků standardizace vitaminu D v programu VDSP (vitamin D standardisation program) není zatím výrazný ani v preciznosti, ani v hodnotách bias měření.1

Kromě toho jsou imunochemické metody zatížené v různé míře mnohými interferencemi, např. zkříženou reaktivitou metabolitů (1,25(OH)2D, 24,25(OH)2D, C3-epimer), rozdílnou efektivitou uvolnění vitaminu D z vazby na VDBP (vitamin D binding protein) a vlivem rozdílných koncentrací VDBP u různých skupin pacientů, rozdílnou imunoreaktivitou D2 (ergokalciferolu) a D3 (cholekalciferolu) a vlivem matrice.2,3

24,25-dihydroxyvitamin D (24,25(OH)2D) cirkuluje v krvi v koncentraci mnohem vyšší než 1,25(OH)2D, v rozsahu cca 2–20 % koncentrace celkového 25-hydroxyvitaminu D,4 resp. v koncentraci průměrně přibližně 10 nmol/l.5 Je to první metabolit C-24/C-23 dráhy katabolické přeměny 1,25(OH)2D (kalcitriolu) a 25(OH)D (kalcidiolu) na produkty rozpustné ve vodě. Vzniká účinkem multikatalytického enzymu 24-hydroxylázy (24-OHase, CYP24A1, P4750cc24), která je přítomna v buňkách proximálního tubulu ledvin, ale také pravděpodobně ve všech cílových buňkách kalcitriolu. 1,25(OH)2D je velmi silný induktor 24-hydroxylázy, tento enzym tedy reguluje produkci i degradaci kalcitriolu. V posledních desetiletích se zpochybňuje teze, že 24,25(OH)2D je pouze inaktivním produktem katabolismu, byly prokázány účinky 24,25(OH)2D v metabolismu kostí a chrupavek a v intestinální absorpci Ca.4,5 Měření koncentrace 24,25(OH)2D, resp. poměru 24,25(OH)2D : 25(OH)D může sloužit jako indikátor stavu katabolismu vitaminu D nebo v diagnostice inaktivačních mutací CYP24A1.6,7 Na druhou stranu může 24,25(OH)2D významně přispívat k systémovým analytickým diferencím mezi jednotlivými imunometodami, resp. k pozitivní bias u metod, které vykazují zkříženou reaktivitu.

Nižší koncentrace 24,25(OH)2D je nalézána u pacientů s chronickou renální insuficiencí vlivem inhibice 24-hydroxylázy a stagnujícího metabolismu vitaminu D,8 naopak vyšší koncentrace 24,25(OH)2D jsou popsány u osob s vysokými koncentracemi vitaminu D v korelaci s koncentrací 25(OH)D.4,6,7,9

Materiál a metody

Společnost Roche Diagnostics v nedávné době uvedla na trh novou generaci soupravy Vitamin D total II pro stanovení koncentrace 25(OH)D (kat. č. 07464215 190), u které deklaruje vzhledem k použití specifické blokační monoklonální protilátky vysoce potlačenou zkříženou reaktivitu 24,25(OH)2D.10 Měli jsme možnost porovnat stanovení koncentrace 25(OH)D touto metodou a metodou Architect 25-OH Vitamin D (Abbott, kat. č. 5P02), kterou rutinně měříme 25(OH)D. Obě metody jsou na bázi luminiscence v kompetitivním uspořádání, principem stanovení Roche je elektrochemiluminiscence (ECLIA) s využitím VDBP značeného rutheniem, principem Abbott je chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích (CMIA) se značením akridiniem.10,11 Analytické charakteristiky obou metod shrnuje tabulka 1.

V období mezi 10/2017 a 01/2018 jsme provedli měření 190 pacientských vzorků, které byly do laboratoře odeslány z různých oddělení Thomayerovy nemocnice s různou diagnózou a požadavkem na vyšetření koncentrace 25-hydroxyvitaminu D. Věk pacientů se pohyboval v rozsahu 1–92 let (průměrně 57,4 let), poměr žen k mužům cca 2,2 : 1. Po odběru a separaci byla séra zamražena při -20 °C. 2x týdně byla po rozmražení a temperování vzorků simultánně změřena koncentrace 25(OH)D na analyzátoru Architect i1000 (Abbott) a současně cobas^® 8000 (Roche). Během celého měření byla používána jedna šarže reagencie Roche (273982); eGFR byla vypočtena dle Lund-Malmö; mezilehlá preciznost byla vypočtena z výsledků opakovaného měření materiálů určených pro interní kontrolu kvality (PreciControl Vitamin D total II). 

Vzhledem k možným rozdílným koncentracím 24,25(OH)2D u skupiny pacientů s chronickou renální insuficiencí a u pacientů s vysokou koncentrací vit. D (viz výše) jsme vzorky rozdělili do tří skupin: 
• skupina 1: eGFR <= 1,0 ml/s/1,73 m2 a zároveň 25(OH)D < 75 nmol/l (měřeno metodou Abbott), 
• skupina 2: 25(OH)D >= 75 nmol/l (měřeno metodou Abbott) a zároveň eGFR > 1,0 ml/s/1,73 m2, 
• skupina 3: 25(OH)D < 75 nmol/l (měřeno metodou Abbott) a zároveň eGFR > 1,0 ml/s/1,73 m2. 

Z porovnávání jsme vyloučili vzorky, u kterých byla zároveň koncentrace 25(OH)D >= 75 nmol/l a eGFR <= 1,0 ml/s/1,73 m2 (s cílem zamezit sumaci hypotetických vlivů na koncentraci 24,25(OH)2D), a hemolytické vzorky (H index nad 500). Taktéž byl vyřazen vzorek, ve kterém byl prokázán monoklonální imunoglobulin IgG-lambda ve vysoké koncentraci, podílející se pravděpodobně na extrémních rozdílech výsledků 25(OH)D získaných srovnávanými analytickými systémy.

Naměřená data jsme zpracovali pomocí statistického programu MedCalc, verze 17.7.2 (Bland-Altmanovy diferenční grafy, Passing-Bablokova regresní analýza, krabicový graf, Spearmanův korelační koeficient, Wilcoxonův párový test s Bonferroniho korekcí hladin významnosti, Mann-Whitneyův test).

Výsledky a diskuze

Statistické výsledky popisují tabulky 2 a 3.

Jak je patrné z tabulky 3 a grafů 1 a 2, posunutí je významné (nenulové) u skupiny 3, což se projevuje také při hodnocení všech vzorků dohromady. Stejně tak je u skupiny 3 směrnice hraničně odchýlena od 1 a při hodnocení všech vzorků dohromady je odchýlení směrnice významné (různé od 1). Ve skupině 3 a zároveň při hodnocení všech vzorků dohromady byla tedy odhalena jak systematická, tak proporcionální odchylka obou porovnávaných metod. Nejširší interval SD reziduí jsme nalezli u skupiny 2 s vysokými hodnotami 25(OH)D. Statisticky významný rozdíl hodnot měřených Roche vs. Abbott (p < 0,001 po Bonferroniho korekci) jsme nalezli pouze u skupiny 2 (viz graf 1).

Bland-Altmanovy diferenční grafy ukázaly průměrnou diferenci Roche vs. Abbott -3,2 % (-0,6 nmol/l) ve skupině 1, 10,3 % (9,5 nmol/l) ve skupině 2 a -3,2 % (-1,2 nmol/l) ve skupině 3 (při hodnocení všech vzorků 1,5 %, 2,7 nmol/l). Nejvyšší rozdíl byl nalezen ve skupině 2 s relativně vysokými koncentracemi 25(OH)D, což může být způsobeno vyšším zastoupením 24,25(OH)2D a nadhodnocením metodou Abbott. Tomu by odpovídala i změna trendu: výsledky Abbott byly na rozdíl od všech ostatních skupin ve skupině 2 většinou vyšší než Roche (viz též graf 2). Rozdíl mezi metodami se mírně stírá ve skupině 1 se sníženou eGFR (eGFR v této skupině byla v rozsahu 0,15–1,0 ml/s/1,73 m2, odpovídá 3.–5. stadiu CKD dle KDOQI guidelines). Diference se mírně zvyšuje s rostoucí tíží renálního poškození, u pacientů s velmi nízkou eGFR (pod 0,5 ml/s/1,73 m2) dosáhla -6,9 %, resp. -3,1 nmol/l, nicméně takových dat bylo málo pro validní statistické výstupy (n = 13). Je také otázka, nakolik jsou nálezy v této skupině ovlivněny rozdílnou koncentrací VDBP u dialyzovaných pacientů a rozdíly v efektivitě uvolnění vit. D z vazby na VDBP vlivem matrice (zvýšené koncentrace urey nebo jiných retenčních metabolitů u dialyzovaných pacientů). Taktéž je třeba zdůraznit, že na rozdílných výsledcích v jednotlivých skupinách se mohou zčásti podílet také další vlivy, které potenciálně mohou způsobovat interferenci u imunochemických stanovení (viz úvod).

U skupin 1 a 3 a hodnocení všech vzorků dohromady jsme nalezli zcela obdobné výsledky jako kolektiv autorů z Ostravy (12) při porovnání výsledků měření 25(OH)D inovovanou metodou Roche a metodou 25-OH Vitamin D total Assay na systému LIAISON (DiaSorin), ve skupině 2 jsme nalezli mírně vyšší rozdíl mezi námi porovnávanými analytickými systémy.

Výsledky měřené analytickými systémy Roche a Abbott poměrně těsně korelovaly, Spearmanův korelační koeficient pro 1. skupinu je 0,902, pro 2. skupinu 0,748 a pro 3. skupinu 0,874 (pro všechny výsledky 0,948).

Ve skupině pacientů s eGFR pod 1,0 ml/s/1,73 m2 dosáhlo zastoupení deficitu vit. D (cut-off 50 nmol/l 25(OH)D) 46,6 % (27/58) oběma metodami zcela shodně, což odpovídá očekávanému nálezu nízkých koncentrací vit. D u pacientů s chronickým onemocněním ledvin. Ve skupině všech výsledků (bez omezení dle eGFR) bylo opět oběma metodami srovnatelně vyhodnoceno zastoupení pacientů s deficitem vit. D, resp. 29,5 % (56/190) metodou Abbott a 30,5 % (58/190) metodou Roche. Hodnoty 25(OH)D se statisticky významně lišily ve skupině snížené eGFR (<= 1,0 ml/s/1,73 m2) v porovnání se skupinou s nesníženou eGFR (> 1,0 ml/s/1,73 m2), shodně při měření oběma analytickými systémy (Mann-Whitneyův test, p < 0,0001). Vztah koncentrace 25(OH)D a eGFR ukazuje graf 3.

Ke kalibraci metody byl použit firemní kalibrační materiál Vitamin D total CalSet. V průběhu našeho měření byly použity 2 šarže kontrolního materiálu (219897, exp. 12/2017 a 263243, exp. 8/2018). Statistický soubor dat kontroly kvality pro jednotlivé šarže však není příliš velký, což se může odrážet na získaných SD a CV.

Výsledky interní kontroly kvality (IKK) viz tabulka 4.

Závěr

Porovnávali jsme stanovení koncentrace 25(OH)D inovovanou metodou Roche a metodou Abbott na velkém počtu vzorků a v širokém rozmezí hodnot. Ačkoliv výsledky spolu dobře korelovaly, ve shodě s údaji z literatury jsme nalezli rozdíly mezi výsledky měření těmito dvěma analytickými systémy. V komplexních souvislostech však nepovažujeme tyto diference za klinicky významné, četnost výsledků na úrovni deficitu vitaminu D vyhodnocená oběma analytickými systémy byla téměř shodná. Systematická odchylka se mírně zvyšuje u vyšších koncentrací 25(OH)D, kde inovovaná metoda Roche vydává nižší výsledky, pravděpodobně vlivem potlačené zkřížené reaktivity 24,25(OH)2D.