article main title
Stanovení koncentrace 25-OH vitaminu D inovovanou metodou Roche
MUDr. Klára Bořecká 1
1) Oddělení klinické biochemie Thomayerovy nemocnice v Praze

Vliv vitaminu D na regulaci koncentrace kalcia a metabolismus kostní tkáně je již dlouhá desetiletí znám, novější studie prokazují další extraskeletální vlivy tohoto hormonu. Receptory vitaminu D byly nalezeny v řadě tkání, dá se tedy předpokládat velmi rozmanitý účinek na zdraví člověka.

Úvod

V důsledku zvýšeného zájmu o vitamin D v příčinné asociaci se širokým spektrem onemocnění se také dramaticky zvýšil počet požadavků na vyšetření koncentrace vitaminu D, resp. celkového 25-hydroxyvitaminu D (25(OH)D). Avšak vzhledem k různým nepříznivým faktorům, jako je hydrofobicita molekuly, vazba na bílkovinné přenašeče a přítomnost řady různých metabolitů vitaminu D, je stanovení obtížné a stále se potýká s určitými analytickými problémy.
Navzdory tomu, že je ID-LC-MS/MS ustanovena referenční metodou stanovení vitaminu D, v laboratořích se rutinně používají snadnější a rychlejší automatizované imunochemické metody. Tyto však nejsou dosud dostatečně standardizované, prozatímní pozitivní efekt výsledků standardizace vitaminu D v programu VDSP (vitamin D standardisation program) není zatím výrazný ani v preciznosti, ani v hodnotách bias měření.1

Kromě toho jsou imunochemické metody zatížené v různé míře mnohými interferencemi, např. zkříženou reaktivitou metabolitů (1,25(OH)2D, 24,25(OH)2D, C3-epimer), rozdílnou efektivitou uvolnění vitaminu D z vazby na VDBP (vitamin D binding protein) a vlivem rozdílných koncentrací VDBP u různých skupin pacientů, rozdílnou imunoreaktivitou D2 (ergokalciferolu) a D3 (cholekalciferolu) a vlivem matrice.2,3

Cholekalciferol a Ergokalciferol

24,25-dihydroxyvitamin D (24,25(OH)2D) cirkuluje v krvi v koncentraci mnohem vyšší než 1,25(OH)2D, v rozsahu cca 2–20 % koncentrace celkového 25-hydroxyvitaminu D,4 resp. v koncentraci průměrně přibližně 10 nmol/l.5 Je to první metabolit C-24/C-23 dráhy katabolické přeměny 1,25(OH)2D (kalcitriolu) a 25(OH)D (kalcidiolu) na produkty rozpustné ve vodě. Vzniká účinkem multikatalytického enzymu 24-hydroxylázy (24-OHase, CYP24A1, P4750cc24), která je přítomna v buňkách proximálního tubulu ledvin, ale také pravděpodobně ve všech cílových buňkách kalcitriolu. 1,25(OH)2D je velmi silný induktor 24-hydroxylázy, tento enzym tedy reguluje produkci i degradaci kalcitriolu. V posledních desetiletích se zpochybňuje teze, že 24,25(OH)2D je pouze inaktivním produktem katabolismu, byly prokázány účinky 24,25(OH)2D v metabolismu kostí a chrupavek a v intestinální absorpci Ca.4,5 Měření koncentrace 24,25(OH)2D, resp. poměru 24,25(OH)2D : 25(OH)D může sloužit jako indikátor stavu katabolismu vitaminu D nebo v diagnostice inaktivačních mutací CYP24A1.6,7 Na druhou stranu může 24,25(OH)2D významně přispívat k systémovým analytickým diferencím mezi jednotlivými imunometodami, resp. k pozitivní bias u metod, které vykazují zkříženou reaktivitu.

Nižší koncentrace 24,25(OH)2D je nalézána u pacientů s chronickou renální insuficiencí vlivem inhibice 24-hydroxylázy a stagnujícího metabolismu vitaminu D,8 naopak vyšší koncentrace 24,25(OH)2D jsou popsány u osob s vysokými koncentracemi vitaminu D v korelaci s koncentrací 25(OH)D.4,6,7,9

Materiál a metody

Tab. 1: Analytické charakteristiky metod deklarované výrobcem 
Zkratky ECLIA a CMIA viz text výše. 
* Bez „mrtvého“ objemu. 
** Vzorek byl připraven s přidaným 24,25(OH)2D3 v koncentraci 100 µg/l, ve třech koncentracích celkového 25-OH vitaminu D (přibližně 25, 40 a 60 µg/l). 
*** Vzorky byly připraveny s přidaným 24,25(OH)2D3 nebo 24,25(OH)2D2 v koncentraci 100 µg/l, ve třech koncentracích celkového 25-OH vitaminu D (přibližně 20, 30 a 40 µg/l).

Společnost Roche Diagnostics v nedávné době uvedla na trh novou generaci soupravy Vitamin D total II pro stanovení koncentrace 25(OH)D (kat. č. 07464215 190), u které deklaruje vzhledem k použití specifické blokační monoklonální protilátky vysoce potlačenou zkříženou reaktivitu 24,25(OH)2D.10 Měli jsme možnost porovnat stanovení koncentrace 25(OH)D touto metodou a metodou Architect 25-OH Vitamin D (Abbott, kat. č. 5P02), kterou rutinně měříme 25(OH)D. Obě metody jsou na bázi luminiscence v kompetitivním uspořádání, principem stanovení Roche je elektrochemiluminiscence (ECLIA) s využitím VDBP značeného rutheniem, principem Abbott je chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích (CMIA) se značením akridiniem.10,11 Analytické charakteristiky obou metod shrnuje tabulka 1.

V období mezi 10/2017 a 01/2018 jsme provedli měření 190 pacientských vzorků, které byly do laboratoře odeslány z různých oddělení Thomayerovy nemocnice s různou diagnózou a požadavkem na vyšetření koncentrace 25-hydroxyvitaminu D. Věk pacientů se pohyboval v rozsahu 1–92 let (průměrně 57,4 let), poměr žen k mužům cca 2,2 : 1. Po odběru a separaci byla séra zamražena při -20 °C. 2x týdně byla po rozmražení a temperování vzorků simultánně změřena koncentrace 25(OH)D na analyzátoru Architect i1000 (Abbott) a současně cobas® 8000 (Roche). Během celého měření byla používána jedna šarže reagencie Roche (273982); eGFR byla vypočtena dle Lund-Malmö; mezilehlá preciznost byla vypočtena z výsledků opakovaného měření materiálů určených pro interní kontrolu kvality (PreciControl Vitamin D total II). 

Vzhledem k možným rozdílným koncentracím 24,25(OH)2D u skupiny pacientů s chronickou renální insuficiencí a u pacientů s vysokou koncentrací vit. D (viz výše) jsme vzorky rozdělili do tří skupin: 
skupina 1: eGFR <= 1,0 ml/s/1,73 m2 a zároveň 25(OH)D < 75 nmol/l (měřeno metodou Abbott), 
skupina 2: 25(OH)D >= 75 nmol/l (měřeno metodou Abbott) a zároveň eGFR > 1,0 ml/s/1,73 m2, 
skupina 3: 25(OH)D < 75 nmol/l (měřeno metodou Abbott) a zároveň eGFR > 1,0 ml/s/1,73 m2. 

Z porovnávání jsme vyloučili vzorky, u kterých byla zároveň koncentrace 25(OH)D >= 75 nmol/l a eGFR <= 1,0 ml/s/1,73 m2 (s cílem zamezit sumaci hypotetických vlivů na koncentraci 24,25(OH)2D), a hemolytické vzorky (H index nad 500). Taktéž byl vyřazen vzorek, ve kterém byl prokázán monoklonální imunoglobulin IgG-lambda ve vysoké koncentraci, podílející se pravděpodobně na extrémních rozdílech výsledků 25(OH)D získaných srovnávanými analytickými systémy.

Naměřená data jsme zpracovali pomocí statistického programu MedCalc, verze 17.7.2 (Bland-Altmanovy diferenční grafy, Passing-Bablokova regresní analýza, krabicový graf, Spearmanův korelační koeficient, Wilcoxonův párový test s Bonferroniho korekcí hladin významnosti, Mann-Whitneyův test).

Výsledky a diskuze

Tab. 2: Souhrnná statistika

Statistické výsledky popisují tabulky 2 a 3.

Tab. 3: Passing-Bablokova regresní analýza
Graf 1: Krabicové grafy jednotlivých skupin + hodnocení významnosti rozdílů Wilcoxonovým párovým testem (hladiny významnosti po Bonferroniho korekci)

Jak je patrné z tabulky 3 a grafů 1 a 2, posunutí je významné (nenulové) u skupiny 3, což se projevuje také při hodnocení všech vzorků dohromady. Stejně tak je u skupiny 3 směrnice hraničně odchýlena od 1 a při hodnocení všech vzorků dohromady je odchýlení směrnice významné (různé od 1). Ve skupině 3 a zároveň při hodnocení všech vzorků dohromady byla tedy odhalena jak systematická, tak proporcionální odchylka obou porovnávaných metod. Nejširší interval SD reziduí jsme nalezli u skupiny 2 s vysokými hodnotami 25(OH)D. Statisticky významný rozdíl hodnot měřených Roche vs. Abbott (p < 0,001 po Bonferroniho korekci) jsme nalezli pouze u skupiny 2 (viz graf 1).

Graf 2: Passing-Bablokova regresní analýza  
2A: skupina 1, 2B: skupina 2, 2C: skupina 3, 2D: všechny výsledky 

Bland-Altmanovy diferenční grafy ukázaly průměrnou diferenci Roche vs. Abbott -3,2 % (-0,6 nmol/l) ve skupině 1, 10,3 % (9,5 nmol/l) ve skupině 2 a -3,2 % (-1,2 nmol/l) ve skupině 3 (při hodnocení všech vzorků 1,5 %, 2,7 nmol/l). Nejvyšší rozdíl byl nalezen ve skupině 2 s relativně vysokými koncentracemi 25(OH)D, což může být způsobeno vyšším zastoupením 24,25(OH)2D a nadhodnocením metodou Abbott. Tomu by odpovídala i změna trendu: výsledky Abbott byly na rozdíl od všech ostatních skupin ve skupině 2 většinou vyšší než Roche (viz též graf 2). Rozdíl mezi metodami se mírně stírá ve skupině 1 se sníženou eGFR (eGFR v této skupině byla v rozsahu 0,15–1,0 ml/s/1,73 m2, odpovídá 3.–5. stadiu CKD dle KDOQI guidelines). Diference se mírně zvyšuje s rostoucí tíží renálního poškození, u pacientů s velmi nízkou eGFR (pod 0,5 ml/s/1,73 m2) dosáhla -6,9 %, resp. -3,1 nmol/l, nicméně takových dat bylo málo pro validní statistické výstupy (n = 13). Je také otázka, nakolik jsou nálezy v této skupině ovlivněny rozdílnou koncentrací VDBP u dialyzovaných pacientů a rozdíly v efektivitě uvolnění vit. D z vazby na VDBP vlivem matrice (zvýšené koncentrace urey nebo jiných retenčních metabolitů u dialyzovaných pacientů). Taktéž je třeba zdůraznit, že na rozdílných výsledcích v jednotlivých skupinách se mohou zčásti podílet také další vlivy, které potenciálně mohou způsobovat interferenci u imunochemických stanovení (viz úvod).

U skupin 1 a 3 a hodnocení všech vzorků dohromady jsme nalezli zcela obdobné výsledky jako kolektiv autorů z Ostravy (12) při porovnání výsledků měření 25(OH)D inovovanou metodou Roche a metodou 25-OH Vitamin D total Assay na systému LIAISON (DiaSorin), ve skupině 2 jsme nalezli mírně vyšší rozdíl mezi námi porovnávanými analytickými systémy.

Výsledky měřené analytickými systémy Roche a Abbott poměrně těsně korelovaly, Spearmanův korelační koeficient pro 1. skupinu je 0,902, pro 2. skupinu 0,748 a pro 3. skupinu 0,874 (pro všechny výsledky 0,948).

Graf 3: Vztah mezi koncentrací 25(OH)D
(měřeno Roche) a eGFR (dle Lund-Malmö) 

Ve skupině pacientů s eGFR pod 1,0 ml/s/1,73 m2 dosáhlo zastoupení deficitu vit. D (cut-off 50 nmol/l 25(OH)D) 46,6 % (27/58) oběma metodami zcela shodně, což odpovídá očekávanému nálezu nízkých koncentrací vit. D u pacientů s chronickým onemocněním ledvin. Ve skupině všech výsledků (bez omezení dle eGFR) bylo opět oběma metodami srovnatelně vyhodnoceno zastoupení pacientů s deficitem vit. D, resp. 29,5 % (56/190) metodou Abbott a 30,5 % (58/190) metodou Roche. Hodnoty 25(OH)D se statisticky významně lišily ve skupině snížené eGFR (<= 1,0 ml/s/1,73 m2) v porovnání se skupinou s nesníženou eGFR (> 1,0 ml/s/1,73 m2), shodně při měření oběma analytickými systémy (Mann-Whitneyův test, p < 0,0001). Vztah koncentrace 25(OH)D a eGFR ukazuje graf 3.

Ke kalibraci metody byl použit firemní kalibrační materiál Vitamin D total CalSet. V průběhu našeho měření byly použity 2 šarže kontrolního materiálu (219897, exp. 12/2017 a 263243, exp. 8/2018). Statistický soubor dat kontroly kvality pro jednotlivé šarže však není příliš velký, což se může odrážet na získaných SD a CV.

Výsledky interní kontroly kvality (IKK) viz tabulka 4.

Závěr

Porovnávali jsme stanovení koncentrace 25(OH)D inovovanou metodou Roche a metodou Abbott na velkém počtu vzorků a v širokém rozmezí hodnot. Ačkoliv výsledky spolu dobře korelovaly, ve shodě s údaji z literatury jsme nalezli rozdíly mezi výsledky měření těmito dvěma analytickými systémy. V komplexních souvislostech však nepovažujeme tyto diference za klinicky významné, četnost výsledků na úrovni deficitu vitaminu D vyhodnocená oběma analytickými systémy byla téměř shodná. Systematická odchylka se mírně zvyšuje u vyšších koncentrací 25(OH)D, kde inovovaná metoda Roche vydává nižší výsledky, pravděpodobně vlivem potlačené zkřížené reaktivity 24,25(OH)2D.

Tab. 4: Výsledky interní kontroly kvality – mezilehlá preciznost (období 10/2017 – 01/2018) * Hodnota deklarovaná výrobcem.
MUDr. Klára Bořecká

MUDr. Klára Bořecká


Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.