article main title
Různé způsoby sušení tkáňových řezů pro imunohistochemické vyšetření
MUDr. Petra Kašparová, Ph.D. 1
1) Fingerlandův ústav patologie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Hradci Králové Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové

Sušení/zapékání tkáňových řezů (v anglické terminologii jsou používány výrazy „airdrying“ a „baking“) je důležitým krokem standardního imunohistochemického vyšetření. Přesto, že je tento krok velmi jednoduchý, významně ovlivňuje konečný výsledek. Jeho účelem je zlepšit přilnutí tkáňového řezu k podložnímu sklu a zabránit jeho ztrátě, tzv. „odplavání“, popř. odtrávení především v následném kroku oživení antigenu (HIer – teplem navozené, popř. enzymatické oživení). Dále dochází k odstranění vodních kapek pod řezem, které mohou v dalších krocích vést ke vzniku barvicích artefaktů.

Standardních způsobů sušení tkáňových řezů je několik a jejich využití se odvíjí od provozu jednotlivých laboratoří. Skla s tkáňovými řezy je možné sušit 24 hodin při laboratorní teplotě (rt) nebo v termostatu, a to přes noc při 37 °c nebo 1 hodinu při 60 °c. v imunohistochemické laboratoři ve Fingerlandově ústavu se pro statimová vyšetření využívá k sušení mikrovlnná trouba, v níž se doba sušení zkrátí na 5 minut. tato metoda sušení je vzhledem ke své rychlosti velmi zajímavá, ale měli jsme obavy, zda nedochází k degradaci řezů a k ovlivnění jejich vlastností s ohledem na imunohistochemickou reakci. Proto jsme se zaměřili na porovnání standardně používaných metod sušení tkáňových řezů (24 hodin při laboratorní teplotě, 1 hodinu při teplotě 60 °c) a metody využívající mikrovlnnou troubu (5 minut při výkonu 450 W). Kromě těchto metod, které jsou univerzální, jsme do testování zahrnuli i metodu sušení přímo ve stroji ventana BenchMark Ultra, tzv. „on board“. Standardní protokol, který je výrobcem doporučován, obsahuje na počátku sušení v přístroji po dobu 4 minut. tuto dobu jsme prodloužili na 16 min (při teplotě 68 °c). Skla s řezy nebyla před vložením do stroje nijak sušena.

Metodika a materiál

Dvě nezávislé laboratoře (Fingerlandův ústav patologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové, a AeskuLab Patologie, k. s.) porovnávaly kvalitu histochemického barvení tkáňových řezů z  tkáňové microarray při použití čtyř různých způsobů sušení/zapékání.

TMA

V tkáňové microarray (TMA) byly zastoupeny tyto typy nenádorových i nádorových tkání: patrová tonzila fixovaná 24 hodin, patrová tonzila fixovaná 48 hodin, pankreas, pigmentový névus (kůže), apendix centrální oblast, apendix periferní oblast, dlaždicobuněčný karcinom dobře diferencovaný (SqCC gr I), dlaždicobuněčný karcinom nízce diferencovaný (SqCC gr III), prostata, tuba, čípek normální, čípek s high grade skvamózní intraepiteliální lézí (H-SIL), játra, ledvina a nadledvina.

Preparáty tkáňových řezů byly sušeny/ zapékány: 24 hodin při laboratorní teplotě (RT), 1 hodinu v  termostatu při teplotě 60 °C, 5 minut v  mikrovlnné troubě při výkonu 450 W; a rovněž byly použity řezy nesušené, se sušením „on board“ přímo v  automatech Ventana BenchMark Ultra, kde byl počáteční čas sušení skel prodloužen na dobu 16 minut (při teplotě 68 °C).

Imunohistochemické vyšetření bylo provedeno s následujícími RTU primárními protilátkami (všechny protilátky od firmy Ventana Roche): pankeratin (760-2595), cytokeratin 8&18 (760-4344), cytokeratin 5/14 (760-4939), e-cadherin (790-4497), vimentin (790-2917), CD34 (790-2927), WT1 (760-4397), Ki-67 (790-4286), S100  
(790-2914), MART-1/melan A (790-2990), HMB45 (790-4366).

Obě laboratoře pracovaly podle stejných protokolů s  detekčními kity Ultraview nebo Optiview. Při hodnocení výsledků barvení jsme se zaměřili především na to, zda byly všechny buňky obarveny dle očekávání, zda byly zachovány tkáňové terčíky a zda barvení bylo rovnoměrné na celém skle.

Tkáňová microarray, přehled: 
A cytokeratin, low molecular weight (CKLMW); B cytokeratin, high molecular weigh
C vimentint (CKHMW); D Ki-67,
Tkáňová microarray, vimentin, různé způsoby sušení/zapékání: 
E 24h, RT; F termostat, 1h, 60 °C 
G mikrovlnná  trouba; H „on board“
(pozn.: terčíky játra a normální čípek se v průběhu zpracování vykrájely, nejde o ztrátu v průběhu sušení/zapékání)

Výsledky

Výsledky barvení byly obdobné při všech způsobech sušení tkáňových řezů, nezaznamenali jsme žádné významné rozdíly v počtu ztracených terčíků ani v homogenitě a intenzitě barvení.

Závěr/shrnutí

Detail „on board“ sušení/zapékání

Výsledek našeho experimentu ukazuje, že všechny použité způsoby sušení/zapékání tkáňových řezů (24 hodin při laboratorní teplotě (RT), 1 hodinu v termostatu při teplotě 60 °C, 5 minut v mikrovlnné troubě při výkonu 450 W a sušení 16 minut při teplotě 68 °C „on board“ přímo v  automatech Ventana BenchMark Ultra) vykazují obdobné výsledky, zapékání v mikrovlnné troubě zároveň i výrazně zkracuje dobu přípravy imunohistochemických preparátů. Pracovníci laboratoře si tak mohou libovolně vybrat způsob sušení s ohledem na aktuální potřeby a laboratorní „workflow“.

V  rutinní praxi (zejména pracoviště Aeskulab Patologie, k. s.) se navíc ukazuje, že zapékání preparátů v mikrovlnné troubě vede k lepšímu přilnutí tkáňových řezů (typicky tkáně s vysokým podílem tukové komponenty, jako např. prs) k podložnímu sklu než u dosud požívaných standardních způsobů sušení. Snižuje se tak počet tzv. poplavaných tkáňových řezů (u kterých je nutné imunohistochemické vyšetření opakovat), a to i u velmi problematických tkání. Je však nutné dodržovat výkon mikrovlnné trouby. Empiricky jsme prokázali, že nadměrné zvýšení výkonu mikrovlnné trouby (5 minut, 900 W) vede ke  ztrátě požadovaných vlastností řezů a reakce jsou negativní. 
 

MUDr. Petra Kašparová, Ph.D.

MUDr. Petra Kašparová, Ph.D.


Na FÚP pracuje již od roku 2001. Její odborná orientace zahrnuje kromě všeobecné patologie problematiku hematopatologie (onemocnění mízních uzlin a kostní dřeně) a neuropatologie (nádorová onemocnění mozku). Spolu s běžnou rutinní bioptickou praxí je odborným asistentem na lékařské fakultě a vedoucím lékařem imunohistochemické laboratoře FÚP. K imunohistochemii se dostala vlastně náhodou – laborantky byly zvyklé chodit k nim do pracovny za jejím kolegou a své zvyky nezměnily, ani když kolega odešel na jiné pracoviště. Na imunohistochemii ji baví mimo jiné i to, že se díky tomu seznámila s lidmi, se kterými by se jinak nepotkala.

Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.