Tento příspěvek poskytuje stručný přehled různých metod měření HbA1c. Obecně existují dvě hlavní kategorie metod. První zahrnuje metody, které jsou založeny na rozdílu v náboji molekul, jako jsou kationtoměničová vysoce účinná kapalinová chromatografie (CE-HPLC) a kapilární elektroforéza. Druhá kategorie se skládá z metod založených na strukturálních rozdílech, jako jsou afinitní vysokoúčinná kapalinová chromatografie (afinitní-HPLC) a imunochemické testy. Jedním ze základních rozdílů mezi typy je, že u metod založených na rozdílech nábojů je nutné kvůli správnému výpočtu HbA1c vyloučit všechny nefyziologické formy, zatímco u metod založených na strukturálních rozdílech tomu tak není. K tomu musí být metody jako CE-HPLC schopny identifikovat všechny přítomné varianty Hb a jejich glykované formy, což může být problematické vzhledem k tomu, že všechny molekuly se stejným elektrickým nábojem budou eluovány ve stejném retenčním čase.1 To může ovlivnit specificitu testu a právě tento potenciální nedostatek specificity brání přijetí CE-HPLC jako referenční metody pro systém IFCC a podnítil vývoj alternativních metod.2
Přehled principů stanovení HBA1c
Referenční metoda
Pracovní skupina IFCC pro standardizaci HbA1c se chopila vývoje referenční metody, která do té doby chyběla. Ta v prvním kroku štěpí hemoglobin na peptidy pomocí enzymu endoproteinázy Glu-C a ve druhém kroku se oddělené neglykované N-terminální hexapeptidy získaného řetězce rozdělí a kvantifikují pomocí HPLC a elektrosprejové ionizační hmotnostní spektrometrie nebo dvourozměrným postupem, využívajícím HPLC a kapilární elektroforézu s UV detekcí [nejdříve provede HPLC (1. separační krok), dále separaci jednotlivých eluátů pomocí kapilární elektroforézy (CE, 2. krok separace), následovanou spektrofotometrickou detekcí při 214 nm, tj. kombinace HPLC-CE]. Oba principy poskytují shodné výsledky. HbA1c se měří jako poměr mezi glykovanými a neglykovanými hexapeptidy. Používají se kalibrátory sestávající ze směsí vysoce purifikovaného HbA1c a HbA0. Analytické parametry referenční metody byly hodnoceny mezinárodní sítí referenčních laboratoří, zahrnující laboratoře z Evropy, Japonska a USA. Interkomparační studie sítě ukázaly vynikající výsledky s intralaboratorními CV v rozmezí 0,5 až 2 % a mezilaboratorními CV 1,4 až 2,3 %. Možné interference byly pečlivě prozkoumány. Kvůli vyšší specificitě referenční metody jsou výsledky nižší než ty, které jsou generovány většinou současných komerčních metod, včetně nejčastěji používaných imunochemických a HPLC metod. Popsaná referenční metoda byla schválena členskými společnostmi Mezinárodní federace klinické chemie a laboratorní medicíny a položila základ pro budoucí jednotné standardizace rutinních testů HbA1c po celém světě.3
Kapilární elektroforéza
Kapilární elektroforéza je metoda založená na náboji, která byla nedávno přizpůsobena testování HbA1c. Hemoglobinové frakce se separují v křemíkových kapilárách při vysokém napětí na základě jejich elektroforetické pohyblivosti a elektroosmotického toku.4 Frakce hemoglobinu se detekují spektrofotometricky.
Stanovení HbA1c iontoměničovou chromatografií je založeno na separaci elektrickým nábojem. Za fyziologických podmínek je volná aminoskupina v terminálním valinu β-řetězce kladně nabitá. Tento kladný náboj je ztracen v důsledku glykace, ale také v důsledku dalších úprav. Metody založené na elektrickém náboji (iontoměničová chromatografie a kapilární elektroforéza) proto mohou potenciálně podléhat interferenci dalších modifikací (např. karbamylace, acetylace, varianty atd.). Chromatografie na katexu zpožďuje kladně nabité kationty, protože stacionární fáze předkládá záporně nabitou funkční skupinu. Všechny látky se stejným nebo podobným nábojem se objeví pod stejným vrcholem, což znamená, že varianty hemoglobinu, které migrují buď s HbA1c, nebo HbA0, mohou způsobit podhodnocení nebo nadhodnocení HbA1c.5 Schopnost detekovat – „vidět“ – varianty u HPLC není spolehlivá, protože mnoho látek migruje se stejným elučním vrcholem.6 Obrázek ukazuje retenční čas pro různé fyziologické varianty Hb, čím pozitivnější je molekula, tím déle zůstává ve sloupci.
Afinitní HPLC
Afinitní chromatografie odděluje molekuly na základě jejich chemické struktury. Pro měření glykovaného hemoglobinu se používají komerčně dostupné afinitní kolony, které obsahují imobilizovanou kyselinu fenylboritou.7 Kyselina boritá reaguje s cis-diolovými skupinami v sacharidových zbytcích GHb (viz obrázek), které zahrnují skupiny ε-aminolysinu.
Afinitní HPLC detekuje celkový glykovaný hemoglobin, ze kterého se HbA1c vypočítává.7
Enzymatické Enzymatické metody jsou založeny na enzymatické kvantifikaci fruktosyldipeptidů pomocí fruktosylpeptidoxidázy. Plná krev je hemolyzována a hemoglobin je přeměněn na methemoglobin. Proteináza uvolňuje N-koncové fruktosyldipeptidy z β-řetězce. Methemoglobin je spektrofotometricky kvantifikován pro výpočet celkového hemoglobinu. Fruktosylpeptidoxidáza odštěpí fruktosyldipeptidy, které vedou k produkci peroxidu vodíku. Peroxid vodíku v kombinaci se substrátem a peroxidázou vytváří specifickou barvu, která je kvantifikována spektrofotometricky a je úměrná koncentraci HbA1c.8
Jak je stanoven HbA1c testy na bázi latexových částic? Testy na základě latexových částic lze provádět na velkých automatizovaných systémech nebo na zařízeních POC (Point-of-Care). U zařízení POC je možné použít jak kapilární krev z odběru z prstu, tak venózní krev, nanesenou přímo do reakční komory.
Jak se stanoví HbA1c imunochemickými metodami?
Imunochemické metody umožňují specifické a automatické stanovení HbA1c na rutinních analyzátorech klinické chemie a POC zařízeních. Používají protilátky, které jsou namířeny proti aminoterminální peptidové sekvenci β-řetězce s jeho glykovanou valinovou skupinou. IFCC definuje HbA1c jako βN1-deoxyfruktosyl hemoglobin.9 Existuje řada komerčních imunotestů. Všechny jsou navrženy pro specifické stanovení HbA1c, ale mohou se lišit v počtu aminokyselin, které protilátka rozpoznává (obvykle 4–10 aminokyselin).
Roche gen. 3
Stanovení Tina-quant Hemoglobin A1c Gen. 3 je založeno na turbidimetrické inhibiční imunoanalýze (TINIA) pro hemolyzovanou plnou krev. GHb (HbA1c) ve vzorku pacienta reaguje s anti-HbA1c protilátkou za vzniku rozpustných komplexů antigen-protilátka. Protože místo pro vazbu specifické protilátky (epitop) je na molekule HbA1c přítomno pouze jednou, nedochází k tvorbě nerozpustných komplexů. Polyhapteny (více epitopů) přidané v dalším stupni reagují s přebytečnými anti-HbA1c protilátkami za vzniku nerozpustného komplexu protilátka-polyhapten, který lze stanovit turbidimetricky. Uvolněný hemoglobin v hemolyzovaném vzorku se stanoví spektrofotometricky.10 Metodu lze použít na analyzátorech COBAS INTEGRA 400 plus, cobas c 111, cobas c 311, cobas c 501, cobas c 502. Systémy cobas c 501/502 disponují speciální sušicí stanicí pro vzorkovou jehlu zajišťující bezpečné pipetování plné krve v rámci stanovení HbA1c. U analyzátorů cobas c 513 (speciální pro stanovení pouze HbA1c s kapacitou 400 vzorků/hod.) a cobas c 503 je přítomná speciální vzorková jehla pro plnou krev.
Pokrokové přístrojové vybavení ROCHE: stanovení HbA1c – laboratorní i POCT
cobas c 503
Vynikající výkon a snadné ovládání. Nová analytická jednotka cobas c 503 nabízí vše, co potřebujete pro vytvoření nových standardů v oblasti spolehlivosti, údržby a efektivity.
• >200 aplikací klinické chemie včetně HbA1c měření z plné krve či hemolyzátu a pipetování speciální vzorkovou jehlou
• Fotometrická technologie s kapacitou až 1000 testů za hodinu
• SonicWash, stanovení sérových indexů, detekce sraženin
• Bezkontaktní ultrazvukové míchání
• 60 pozic pro reagencie cobas c pack green s automatizovanou správou, tj. načítání a automatické vykládání kazet s činidly během provozu a pohotovostního režimu.
cobas b 101
cobas b 101 je diagnostický systém in vitro navržený ke kvantitativnímu stanovení % HbA1c (DCCT / NGSP) a mmol/mol HbA1c (IFCC) v lidské kapilární a venózní plné krvi fotometrickým měřením.
Odhadovaná průměrná hladina glukózy je vypočítána systémem cobas b 101. Systém je určen pro profesionální použití v prostředí klinické laboratoře nebo v místě péče o pacienta.
