article main title
Optimalizovaná metoda Dual ISH v detekci amplifikace genu ERBB2 u karcinomu prsu a žaludku
MUDr. Tomáš Rozkoš, Ph.D. 1
1) Fingerlandův ústav patologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové, Sokolská 581, Hradec Králové 500 12

Vážení čtenáři, metodika in situ hybridizace s detekcí stříbrem (SISH), kterou provozujeme v rutinní histopatologické diagnostice laboratoří molekulární patologie, byla v uplynulém roce optimalizována. V následujícím textu vás chceme stručně informovat o změnách, ke kterým došlo.

Úvod

Přesně před rokem vyšel na stránkách tohoto časopisu článek „Využití in situ hybridizace s detekcí stříbrem (SISH) v rutinní histopatologické diagnostice v laboratořích molekulární patologie“. Článek popisoval metodu a její porovnání s fluorescenční in situ hybridizací. Velká část byla věnována také úskalí preanalytické a analytické fáze vyšetřování případné amplifikace genu ERBB2 (kódujícího protein HER2) u karcinomu prsu a žaludku metodou Dual ISH. Od té doby došlo k úpravě a vylepšení sondy i detekčního postupu, o kterém bychom vás rádi informovali společně s názornými ukázkami a statistikami. Princip metody samotné a typy preanalytických i analytických chyb zůstávají a byly popsány ve zmíněném loňském článku, zde zazní pouze novinky.

Schéma původního (nahoře) a nového (dole) detekčního postupu

Popis jednotlivých vylepšení postupu a jejich významu

První změnou, kterou výrobce provedl, bylo zkrácení délky hybridizačních sond na tzv. oligonukleotidové sondy. Tento krok pomáhá zejména snížit výskyt reanalytických chyb, tedy těch, které se vyskytly v důsledku nekvalitní tkáně, což je v případě in situ hybridizace tkáň s příliš fragmentovanou DNA. Nejčastější příčinou degradace/fragmentace DNA je příliš dlouhá doba fixace tkáně ve formalínu (zpravidla doba přesahující 96 hodin). Zkrácení sond tak alespoň v části takových případů umožňuje provést úspěšnou hybridizaci navázáním kratší sondy na příslušné fragmenty DNA. Úspěšnost je samozřejmě závislá na stupni poškození/fragmentace DNA. Druhou provedenou změnou bylo přidání syntetických vazebných molekul (haptenů) nitropyrazol (NP) a hydroxychinoxalin (HQ) do detekčního postupu jednotlivých sond (viz schéma původní a nové detekce). Vazba primární a sekundární protilátky zprostředkovaná syntetickou molekulou je oproti užití protilátek od dvou různých zvířecích druhů specifičtější. Tato změna pomáhá snížit výskyt analytických chyb spojených s nespecifickým pozadím či slabou intenzitou signálů.

Konečně třetí provedenou změnou je úprava velikosti balení reagencií. Dříve byla dodávána sonda v množství na provedení 50 testů a detekční reagencie na 100 testů. V novém postupu byla velikost balení snížena na objem 30 testů u sondy a 60 testů u detekčních reagencií. Ačkoliv se nejedná o technologické zlepšení, má i toto opatření svůj přínos. Jedním z problémů analytické fáze je totiž „stárnutí“ sondy v důsledku jejího opětovného transportu mezi uskladněním v chladicím boxu a mezi automatem, ve kterém probíhá detekce. Zejména na pracovištích, ve kterých se neprovádí velké počty vyšetření, pak může docházet k analytickým chybám právě v důsledku degradace sondy. Zmenšení obejmu sondy (a tedy počtu vyšetření provedených z jednoho balení) tak napomáhá odstranit tuto podskupinu analytických chyb.

Porovnání původního a nového postupu

Obr. č. 1

V průběhu září 2019 byl na našem pracovišti (Fingerlandův ústav patologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové) testován konsekutivně a prospektivně souběžně původní a nový postup Dual ISH detekce amplifikace genu ERBB2 u karcinomu prsu a žaludku. Celkem bylo souběžně otestováno 13 případů karcinomu prsu a jeden karcinomu žaludku, přičemž ve všech případech byly výsledky detekce novým postupem buď stejné, nebo lepší ve srovnání s původní metodou. Následně jsme ještě novou metodou otestovali šest starších případů, u kterých se původním postupem nepodařilo dosáhnout hodnotitelného výsledku. Z těchto šesti případů byly novou metodou čtyři případy plně hodnotitelné, jeden případ byl technicky limitován, nicméně by umožňoval uvolnit diagnostický závěr, a u jednoho případu se nepodařilo dosáhnout hodnotitelného výsledku ani novým postupem. V testování novou metodou jsme pozorovali v tomto období pouze jednu analytickou chybu, a to absenci signálů v části vyšetřované tkáně (obr. č. 1), nicméně tato „vada“ v žádném z případů nevedla k nemožnosti hodnotit výsledek, neboť vždy byla přítomna nádorová tkáň s řádnou detekcí. Pro lepší představu o komparaci obou postupů dále uvádíme popisy několika porovnávaných případů i s mikrofotografiemi.

Případ č. 1

Karcinom prsu, u něhož byla detekce původním (obr. č. 2a) i novým (obr. č. 2b) postupem hodnotitelná, nicméně při porovnání je vidět lepší kvalita nového postupu, jednotlivé červené i černé signály jsou jasnější a ostřejší a pozadí je „čistší“ v porovnání s detekcí původním postupem.

Obr. č. 2a (vlevo) a  Obr. č. 2b (vpravo)

Případ č. 2

Karcinom prsu, u něhož jsme opakovaně starým postupem detekovali černé signály pouze velmi slabé intenzity (obr. č. 3a), případ tak nebylo možné spolehlivě posoudit. Novým postupem byla intenzita obou barevných signálů vyšší a případ bylo možné hodnotit (obr. č. 3b).

Obr. č. 3a (vlevo) a Obr. č. 3b (vpravo)

Případ č. 3

Karcinom prsu, kdy byly původně zastiženy pouze rozpité červené signály s nespecifickým pozadím a úplnou absencí černých signálů, případ tedy nebylo možné hodnotit (obr. č. 4a). Novým postupem jsou přítomny signály obou barev, byť jsou černé signály drobnější, lze je spolehlivě identifikovat, a tudíž hodnotit (obr. č. 4b).

Obr. č. 4a (vlevo) a Obr. č. 4a (vpravo)

Případ č. 4

Karcinom prsu – původním způsobem je ve tkáni přítomno velké množství nespecifických černých signálů i mimo jádra buněk (tzv. speckling), případ tedy nelze hodnotit (obr. č. 5a). Novým postupem je detekce v pořádku, bez nespecifického pozadí (obr. č. 5b).

Obr. č. 5a (vlevo) a Obr. č. 5b (vpravo)

Případ č. 5

Karcinom prsu, u kterého nebyly opakovaně detekovány žádné signály původním postupem (obr. č. 6a). Pátráním po údajích o vzorku (konzultační materiál z jiného pracoviště) bylo zjištěno, že tkáň byla fixována cca 90 hodin, a tudíž může být poškozena příliš dlouhou fixací. Vyšetření novým postupem však ještě dokázalo částečně fragmentovanou DNA detekovat (dobře patrné černé signály genu ERBB2 a v některých jádrech i červené signály chromozomu 17 viz obr. č. 6b).

Obr. č. 6a (vlevo) a Obr. č. 6b (vpravo)

Případ č. 6

Karcinom prsu s velmi obdobným nálezem jako v předchozím případě (obr. č. 7a). Původní metodou se nepodařilo identifikovat signály a následným pátráním bylo zjištěno, že tkáň byla fixována sedm dní! DNA tedy byla velmi poškozená a ani novým postupem se v invazivním nádoru nepodařilo prokázat signály (obr. č. 7b). Za částečný úspěch lze považovat alespoň průkaz specifických signálů obou barev v in situ složce tumoru (obr. č. 7c), nicméně celkově se z daného materiálu nešlo k amplifikaci vyjádřit. Tkáň byla až příliš poškozená.

Obr. č. 7a (vlevo), Obr. č. 7b (uprostřed) a Obr. č. 7c (vpravo)

Případ č. 7

Karcinom žaludku, imunohistochemicky se silnou expresí proteinu HER2 (3+) a v minulosti Dual ISH hodnocen jako amplifikovaný s tvorbou tzv. clusterů signálů (obr. č. 8a). Nová metoda potvrdila původní závěr, nicméně v nenádorové tkáni je vidět mnohem lepší detekce signálů v porovnání s dřívějším vyšetřením (obr. č. 8b). Nová metoda je tedy stejně úspěšná i u karcinomu žaludku.

Obr. č. 8a (vlevo) a Obr. č. 8b (vpravo)

Statistické porovnání metod

Jelikož se nám nová metoda v přímém porovnání osvědčila, začali jsme na našem pracovišti od října 2019 testovat veškeré případy na amplifikaci genu ERBB2 již pouze novou metodou. V období říjen–prosinec 2019 se v testovaných případech celkem 2x objevily nediagnostické vzorky s preanalytickou chybou a celkem 3x se vyskytla analytická chyba v podobě slabých signálů, které v některých jádrech i úplně chyběly (obr. č. 9). Ve všech těchto třech případech však byla detekce opakovaná stejným postupem již úspěšná (obr. č. 10) a důvod této chyby se nepodařilo zjistit. Ve větším množství případů pak také byla pozorována absence signálů v části vzorku, v žádném z případů to ale nevedlo k nemožnosti daný vzorek hodnotit (vždy byla přítomna i oblast nádoru s plnohodnotnou detekcí). I přes výše zmíněné však počet opakovaných vyšetření z důvodů preanalytických a zejména pak analytických chyb výrazně poklesl oproti původnímu postupu až o 10 %, což nejlépe ilustruje tabulka porovnávající počty vyšetření a jejich opakování za rok 2019 (tab. č. 1).

Obr. č. 9 (vlevo) a Obr. č. 10 (vpravo)
Tab. č. 1: Statistika opakovaných vyšetření v roce 2019

 Závěr

Optimalizovaná metoda Dual ISH detekce amplifikace genu ERBB2 přináší jednoznačně lepší výsledky v porovnání s původním postupem. Cena za test jednoho skla je sice vyšší v porovnání s původním postupem, nicméně pokles počtu opakovaných vyšetření tento fakt plně kompenzuje, neboť nedochází ke zvýšení celkových nákladů na vyšetření. Nová metoda je výrazně robustnější a na základě našich zkušeností můžeme přechod na ni plně doporučit.

MUDr. Tomáš Rozkoš, Ph.D.

MUDr. Tomáš Rozkoš, Ph.D.


Patolog, pracující v oboru od roku 2009, se specializací na onkologickou pneumopatologii a vyšetřování prediktivních markerů pomocí imunohistochemie a in situ hybridizace.

Literatura
  1. Grogan, MT, et al.: Interpretation Guide Ventana INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Assay.
  2. Grogan, MT, et al.: VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Interpretation Guide for Breast and Gastric Carcinoma.
Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.