article main title
Kvantitativní vyšetření hepatitidy B a C
Mgr. Jan Ištvánek, Ph.D. 1
1) Laboratoř molekulární diagnostiky, IFCOR-99, s.r.o.

Úvod

Virové hepatitidy jsou celosvětově nejčastější jaterní onemocnění, které vede až ke 2 milionům úmrtí ročně.1 V současnosti rozeznáváme 6 virů způsobujících virové hepatitidy (označované jako hepatitidy A, B, C, D, E a G). V České republice se běžně vyskytují pouze virové hepatitidy A, B a C. Mnohem závažnější průběh než hepatitida A mají hepatitidy B a C, což souvisí především s jejich schopností přecházet do chronicity. Onemocnění trvající déle než půl roku ústí v chronickou hepatitidu, jaterní cirhózu či rakovinu jater. Následkem chronických forem onemocnění ročně umírá dalších několik milionů osob. Nezanedbatelné jsou také ekonomické ztráty spojené s pracovní neschopností, léčbou apod. Virové hepatitidy tedy i ve 21. století představují velmi významný zdravotnický problém.

Virová hepatitida B je jedním z nejzávažnějších zdravotnických problémů současnosti, především v rozvojovém světě. Během svého života se virem hepatitidy B nakazí více než 2 miliardy osob, přičemž v současnosti je chronicky infikováno 350–400 milionů lidí.1,2,3,4,5 Na následky chronické infekce HBV poté umírá přibližně 15–25 % chronicky infikovaných osob. V celosvětovém měřítku to představuje ročně půl až jeden milion osob, což řadí hepatitidu B mezi deset nejčastějších příčin úmrtí. Na základě posledních sérologických přehledů, které v České republice proběhly, byla chronická infekce virem hepatitidy B prokázána u 0,56 % spoluobčanů.6 Chronická hepatitida B se přitom léčí nejčastěji pomocí 4 účinných preparátů (pegylovaným interferonem (IFN) alfa-2a, konvenčním interferonem alfa, lamivudinem a adefovir dipivoxilem7). Doba léčby je závislá na použitém preparátu, typu viru HBV, léčebné odpovědi pacienta a trvá standardně od 4 do 12 měsíců. 

Virovou hepatitidou C jsou podle kvalifikovaných odhadů nakaženy přibližně 3 % světové populace, přičemž většina přejde do chronicity, jelikož virová hepatitida C je v akutním stadiu rozpoznána jen velmi zřídka. Celosvětově je nemocných více než 180 milionů. Virová hepatitida C je přitom problémem nejen rozvojových zemí, ale i rozvinutých, a to v důsledku nedostupnosti očkování vůči viru hepatitidy C. Počet hlášených případů nově zjištěných hepatitid C v České republice rok od roku narůstá (158 případů nově diagnostikovaných infekcí HCV v roce 1993, 868 případů v roce 2004)6. Protože naprostá většina onemocnění probíhá bezpříznakově a uniká proto pozornosti, budou skutečná čísla výrazně vyšší. Česká republika přesto patří mezi státy s relativně nízkým výskytem infekce HCV okolo 0,2 % populace.6 Během uplynulých desetiletí podstatně rostla účinnost léčby z původních 5 % na současných 50–60 % u nemocných infikovaných virem hepatitidy C typu 1 a 70–80 % u pacientů nakažených typy 2 a 3. Tento pokrok v léčbě je dosahován kombinací pegylovaného interferonu a ribavirinu.8,9 Léčba poté trvá nejčastěji mezi 24 a 48 týdny. 

Graf 1: Srovnání výsledků kvantifikačních kitů pro určení virové nálože HBV v logaritmickém měřítku

Detekce DNA viru HBV a RNA viru HCV pomocí PCR10,11 na rozdíl od vyšetření protilátek prokazuje aktivní replikaci viru, a je tedy důkazem probíhající infekce. Nicméně v případě použití real-time PCR je možné kvantifikovat počáteční množství templátu, tzn. určit aktuální virovou nálož. Kvantifikace virové nálože se v současnosti stala důležitou součástí antivirové terapie chronických hepatitid. Lze ji použít k průkazu i monitorování trvalé i dočasné virologické odpovědi na terapii. Vzhledem k tomu, že význam kvantifikace virové nálože v léčbě pacientů infikovaných HBV nebo HCV stále roste, zaměřili jsme se v následující studii na porovnání nově dostupného testu pro kvantifikaci virové nálože u hepatitidy B a C na automatickém přístroji cobas® 4800 s dřívější, v současnosti však v ČR stále nejpoužívanější metodou, zahrnující manuální izolaci a amplifikaci na přístroji TaqMan® 48.

Metody

Celkem 15 vzorků (4 negativní a 11 pozitivních s různými virovými náložemi) bylo testováno oběma kvantifikačními testy. V případě testování na přístroji cobas® TaqMan® 48 byla nukleová kyselina izolována manuální metodou pomocí kitu High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (Roche) z 500 µl klinického materiálu. K amplifikaci byly použity reagencie kitů cobas® TaqMan® HBV Test (Roche) a cobas® TaqMan® HCV Test, v2.0 (Roche). Mastermix byl namíchán ručně, stejně jako byl do PCR přidán ručně i templát. Izolace nukleových kyselin (ze 400 µl klinického materiálu), příprava mastermixu i příprava PCR reakce do mikrotitrační destičky včetně přidání templátu jsou na přístroji cobas® 4800 automatizovány a probíhají v přístroji cobas® x480. Samotná amplifikace probíhá v real-time cykleru cobas® z480. Všechny použité soupravy byly použity dle návodu výrobce. 

Tab. 1: Srovnání výsledků kvantitativních metod určujících virovou nálož ve vzorku u HBV i HCV

U kvantitativních testů realizovaných na cobas® 4800 určujících virovou nálož HBV a HCV, jako nových laboratorních vyšetření, byla provedena verifikace (mezilehlá preciznost, opakovatelnost) z důvodu ověření základních charakteristik testů. K ověření pracovního rozsahu testů byly simulovány vzorky s různými virovými náložemi. Ověřoval se limit detekce i meze lineárního rozsahu testů. Bylo také ověřeno množství vstupního klinického materiálu a limitu, které je schopen cobas® x480 (izolátor) zpracovat. Dle doporučení výrobce je vstupní množství klinického materiálu stanoveno na 800 µl, přičemž 400 µl je použito k izolaci nukleových kyselin. 400 µl je tudíž mrtvý objem. Vzhledem k možné limitaci ze strany množství materiálu byly vyzkoušeny alternativní sekundární zkumavky (Sarstedt, kat. č. 60.546.002) s jinými rozměry (6 ml, 92 x 11,5 mm), které jsou vhodné pro 32místný nosič, a byl ověřen minimální použitelný objem.

Graf 2: Srovnání výsledků kvantifikačních kitů pro určení virové nálože HCV v logaritmickém měřítku

Výsledky

Srovnáním výsledků obou metod je patrné, že jak vzorky HBV, tak vzorky HCV byly shodně hodnoceny jako pozitivní nebo negativní (u pozitivních výsledků je přímo uvedena hodnota virové nálože; tabulka 1). Srovnáním vypočítaných virových náloží u pozitivních vzorků v logaritmickém měřítku se poté ukazuje, že v případě HBV cobas® 4800 při nízkých virémiích oproti cobas® TaqMan® výsledky mírně nadhodnocuje a při vysokých mírně podhodnocuje (graf 1). U HCV jsou poté oba testy při nízkých virémiích srovnatelné, avšak při vyšších virémiích cobas® 4800 ve srovnání s cobas® TaqMan® výsledky mírně nadhodnocuje (graf 2). V rámci verifikace nových kvantifikačních testů bylo provedeno měření opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti a z naměřených hodnot byly vypočítány základní charakteristiky testu. Naměřené hodnoty i charakteristiky testů jsou shrnuty v tabulce 2. Oba testy vykazují velmi malou odchylku měření, jak lze vidět z výsledků opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti. Malé odchylky měření jsou přitom důležité z hlediska spolehlivosti výsledků a správného monitoringu virové nálože u pacientů s chronickými hepatitidami. 

Tab. 2: Verifikace nových kvantifikačních testů HBV a HCV prováděných na cobas® 4800. Stanovení opakovatelnosti, mezilehlé preciznosti a ověření základních parametrů testů (směrodatná odchylka, variační koeficient, bias a rozšířená kombinovaná nejistota měření)

V rámci ověření pracovního rozsahu kvantitativního testu HBV byl testován limit detekce (4,4 IU/ml) a lineární rozsah (10 IU/ml až 109 IU/ml). U kvantitativního testu HCV pak byl ověřen limit detekce (9,2 IU/ml) a lineární rozsah testu (15 IU/ml až 108 IU/ml) (tabulka 3). V rámci testování detekčního limitu oba testy detekovaly i polovinu limitu detekce stanoveného výrobcem. Přestože limit detekce u obou testů ležel pod dolní mezí lineárního rozsahu testu, v případě HCV byla stanovena virová nálož a celkově výsledky virové nálože při dolní hranici lineárního rozsahu HCV testu byly mírně nadhodnoceny. U vysoce pozitivního HCV vzorku pak byla naměřená virová nálož menší. To však může být způsobeno delším skladováním a opakovaným rozmražením vzorku. V případě testu HBV výsledky ověřující lineární rozsah velmi dobře korelují. 

Tab. 3: Ověření pracovního rozsahu nových kvantifikačních testů

Při testování potřebného vstupního množství klinického materiálu v alternativních sekundárních zkumavkách bylo použito 8 vzorků o různých objemech (450 µl až 800 µl). Minimální vstupní objem vzorku byl tímto experimentem definován na 600 µl, což znamená, že mrtvý objem, který nemůže přístroj použít, se zmenšil na polovinu. Přístroj cobas® x480 byl sice schopen nalézt hladinu a použít i vzorek s objemem 550 µl, nicméně kvůli možné pipetovací chybě nemůžeme toto množství spolehlivě doporučit (obrázek 1).

Obr. 1: Testování vstupního objemu, který je nutný pro zpracování vzorku v alternativních sekundárních zkumavkách

Diskuse

Ze srovnání výsledků testů pro kvantifikaci virové nálože HBV a HCV je patrné, že oba srovnávané systémy poskytují výsledky o velmi dobré shodě. Mírné nadhodnocení nebo podhodnocení výsledků, ať již v rámci srovnání systémů nebo při verifikaci pracovního rozsahu, jsou z klinického hlediska pro lékaře nepodstatné. Jelikož i při hodnocení léčebné odpovědi jsou nejdůležitějším ukazatelem mocninné exponenty virové nálože, bylo i srovnání testů provedeno v logaritmickém měřítku. Verifikací kvantifikačních testů HBV a HCV na automatickém přístroji cobas® 4800 bylo dokázáno, že přístroj splňuje všechny potřebné parametry pro rutinní použití v laboratoři, přičemž eliminuje podstatnou část lidské práce, a tudíž možnost chyby způsobené lidským faktorem. Při ověření pracovního rozsahu bylo navíc prokázáno, že oba testy dokážou detekovat i polovinu detekčního limitu uváděného výrobcem, což umožňuje dostatečnou senzitivitu testu i v případě malých virových náloží v začátcích onemocnění či relapsu. 

Samotný přístroj však potřebuje drobné softwarové i hardwarové úpravy. Izolátor cobas® x480 vyžaduje relativně velký objem klinického materiálu v sekundární zkumavce doporučované výrobcem, aby byl schopen nabrat vzorek k izolaci. To vede k potřebě mnohem většího objemu vzorku (doporučeno je 800 µl), přestože samotná izolace probíhá pouze ze 400 µl klinického materiálu. Určitým východiskem může být volba alternativní sekundární zkumavky, což v našem případě zmenšilo nevyužitý objem na polovinu. Ovšem vhodnějším řešením by byla úprava nastavení izolátoru. Samotný přístroj umožňuje také alternativní postup, izolaci z 200 µl klinického materiálu, který lze použít i s menším vstupním objemem (doporučeno 600 µl). Tato možnost je nicméně spojena s mírně nižší senzitivitou testů a potřebou speciálního diluentu. Protože diluent nebyl v době našeho testování k dispozici, tuto možnost jsme nezkoušeli. V softwaru je poté potřeba zapracovat limity pro dolní i horní meze lineárního rozsahu testů tak, aby byly virové nálože, které jsou pod nebo nad touto hranicí, uváděny na výsledku jako <10 IU/ml nebo >1x109 IU/ml u testu HBV a <15 IU/ml nebo >1x108 IU/ml u testu HCV. V současnosti je totiž uváděno pouze max Titer, což může komplikovat spárování s laboratorním informačním systémem nebo může dojít k lidské chybě při přepisu výsledků, jelikož se u obou testů lineární rozsah liší. Celkově však kvantifikační testy HBV a HCV zpracované přístrojem cobas® 4800 podstatně urychlí čas potřebný k vydání výsledku při současné redukci manuální pracnosti obou metod.

Závěr

V této práci je diskutováno použití přístroje cobas® 4800, který přináší vyšší stupeň automatizace, s dosud používaným systémem cobas® TaqMan® 48, který je založen na manuálním zpracování. Z výsledků testování vyplývá, že obě metody poskytují srovnatelné výsledky. Kvantifikace virové nálože HBV i HCV na přístroji cobas® 4800 splňuje veškeré požadavky kladené na rutinní použití kvantitativních metod v laboratorní praxi. Použitím jiných sekundárních zkumavek lze navíc analýzu spustit bez nutnosti ředění z menšího množství klinického materiálu, především díky zmenšení mrtvého (nevyužitého) objemu. 

Mgr. Jan Ištvánek, Ph.D.

Mgr. Jan Ištvánek, Ph.D.


Literatura
  1. Husa P., Husová L. Virové hepatitidy. 1. vyd. Praha: Galén 2005, 247 s.
  2. Conjeevaram H.S., Lok A.S.F. Management of chronic hepatitis B. J Hepatol 2003; 38 (Suppl. 1): S90–S103.
  3. Lee W.M. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 1997; 337: 1733–1745.
  4. Lok A.S.F, Heathcote E.J., Hoofnagle J.H. Management of hepatitis B: 2000 – Summary of a workshop. Gastroenterology 2000; 120: 1828–1853.
  5. Lok A.S.F, McMahon B.J. Chronic hepatitis B: update of recommendations. AASLD Practice Guideline. Hepatology 2004; 39: 857–861.
  6. Němeček V. Sérologický přehled ČR v roce 2001 – virová hepatitida A, B, C. Zprávy CEM 2003; 12: 55–61.
  1. Ozaras R., Corti G., Ruta S., Lacombe K., Mondelli M.U., Irwing W.L., Puoti M., Khalighi A., Santos M.L., Harxhi A., Lazarevic I., Soriano V., Gervain J., Leblebicioglu H., Salmon D., Arends J.E. Differences in the availability of diagnostics and treatment modalities for chronic hepatitis B across Europe. Clin Microbiol Infec 2015; 21 (11): 1027–1032.
  2. Galský J., Husa P., Kümpel P., Němeček V., Plíšek S., Šperl J., Urbánek P., Volfová M. (abecedně). Diagnostika a léčba chronické virové hepatitidy C (HCV). Doporučený postup České hepatologické společnosti a Společnosti infekčního lékařství z roku 2002. Klin mikrobiol inf lék 2003; 9: 54–56.
  3. Strader D.F.B., Wright T., Thomas D.L., Seeff L. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology 2004; 39: 1147–1171.
  4. Chevaliez S., Pawlotsky J.M. Virology of hepatitis C virus infection. Best Pract Res Cl Ga 2012; 26 (4): 381–389.
  5. Kania D., Ottomani L., Meda N., Peries M., Dujols P., Bolloré K., Rénier W., Viljoen J., Ducos J., Van de Perre P., Tuaillon E. Performance of two real-time PCR assays for hepatitis B virus DNA detection and quantitation. J Virol Methods 2014; 201: 24–30.
Vyhledáváte ve všech kategoriích
Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Diagnostický obor
Analýza moči Centrální laboratoř Digitální diagnostika Hemostáza a koagulace IT řešení a konzultační služby Klinická chemie a imunochemie Molekulární diagnostika POCT Řešení pro centrální laboratoře Sebetestování Sekvenování Tkáňová diagnostika
Klinický obor
Dietologie Endokrinologie Genetika Geriatrie Gynekologie Hematologie Hepatologie Histologie Infekční onemocnění Intenzivní péče Kardiologie Klinická biochemie Neonatologie Neurologie Onkologie Patologie Perinatologie Personalizovaná medicína Porodnictví Prevence Primární péče Transfuziologie Transplantologie

Nebyly nalezeny žádné články.
Zadejte hledaná slova a/nebo zvolte kategorii, která vás zajímá.